實(shí)驗(yàn)五-雞蛋清中卵類粘蛋白分離純化及活性測定(共5頁)

1、實(shí)驗(yàn)五 雞蛋清中卵類粘蛋白分離純化及活性測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?） 設(shè)計從雞蛋清中分離純化卵類粘蛋白的試驗(yàn)方案。2） 設(shè)計從雞蛋清中分離純化卵類粘蛋白的試驗(yàn)操作條件。3） 了解離子交換層析系統(tǒng)中四大組成部分和實(shí)驗(yàn)主要影響因素。4） 掌握熟離子交換層析層析儀的使用方法和注意事項(xiàng)。5） 學(xué)會凝膠預(yù)處理和裝柱、平衡、洗脫的方法。二、器材和試劑1實(shí)驗(yàn)器材：層析系統(tǒng)LH-2，（包括自動部分收集器，紫外檢測儀，記錄儀，蠕動泵，梯度混合器）6套；高速離心機(jī)；布氏漏斗；燒杯500ml,100ml，各16個；移液管1、2、5ml, 各16個；量筒50ml,100ml，各16個；真空干燥器 4個；滴管， 16個；

2、濾紙120， 1盒；2實(shí)驗(yàn)試劑：(1)丙酮；(2)1，pHl.15的三氯乙酸：將稱取的三氯乙酸置燒杯內(nèi)，加入23總體積的蒸餾水溶解，用6molL氯氧化鈉調(diào)至約pHl.15，靜置約1h，然后在pH計上校正至pH 1.15，最后補(bǔ)充水到所配體積；(3)0.02 molL,pH6.5，磷酸鹽緩沖液；(4)0.5molL氯化鈉0.5molL氫氧化鈉溶液；(5)05molL鹽酸溶液；(6)0.3mol/L氯化鈉0.02molL磷酸鹽緩沖液，pH6.5；(7)底物緩沖液：0.05molL，Tris-HCl緩沖液，pH8.0，內(nèi)含2.22molL的氯化鈣；(8)2mmol1,BAEE底物：用底物緩沖液配制；

3、(9)lmgmL胰蛋白酶溶液：用0.001 molL鹽酸配制；(10)DEAE-纖維素粉(DE-32)；(11)SphadexG-25；（12）雞蛋 30個；（13）1硝酸銀三、實(shí)驗(yàn)原理1蛋清中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成為：卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵類粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G2、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黃素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制劑、抗生物素蛋白。2雞卵類粘蛋白(chickenovomucoid，CHOM)的性質(zhì): 雞卵類黏蛋白(chickenovomucoid，CHOM)是由雞卵清中制得的一種糖蛋白，可強(qiáng)烈地抑制胰蛋白酶，對枯草芽孢桿菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但對胰凝乳蛋白酶無抑制作用

4、，對人的胰蛋白酶也無明顯的抑制作用。常用于胰蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究。也可將其制成親和吸附劑，通過親和層析技術(shù)有效地分離與純化胰蛋白酶。雞卵類黏蛋白至今還未能獲得單一組分的制品，目前至少已獲得4種不同組分，它們在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸組成上差別不大，但是在糖基部分(主要為D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸)的含量有差別。由于Ovomucoid所帶的糖基不同，電泳行為呈現(xiàn)出不均一性，其pI大致在3.9-4.5，相對分子質(zhì)量28 000，卵類黏蛋白抑制胰蛋白酶的摩爾比為1：1。卵類黏蛋白在中性或酸性溶液中對熱和高濃度的脲都相當(dāng)穩(wěn)定，而在堿性溶液中不穩(wěn)定，尤其是當(dāng)溫度較高時會迅速失活。Ovo

5、mucoid帶有四種糖基，因此有較強(qiáng)的吸水性。在50%丙酮或5%三氯乙酸鹽的水溶液中，仍有較好的溶解度。所以，選擇合適的pH，丙酮濃度和三氯乙酸鹽的濃度，可以從蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。Ovomucoid 在280nm處的百分消光系數(shù)A1%1cm.280 = 4.13，即蛋白酶濃度為1mg/ml時,溶液的吸光度A280 = 0.413 ，據(jù)此可以測定其溶液中蛋白質(zhì)的含量。本實(shí)驗(yàn)主要參照Kassell的方法，雞蛋清經(jīng)三氯乙酸(TCA)丙酮溶液處理，除去沉淀物，然后經(jīng)丙酮分級沉淀獲得粗晶，再用DEAE-纖維素柱層析純化而得合格產(chǎn)品。四、實(shí)驗(yàn)步驟1雞卵類黏蛋的提取 取50mL雞卵清，加入等體積的1

6、0，pH1.15三氯乙酸溶液(緩緩加入以防局部過酸出現(xiàn)塊狀物)，形成類似于酸奶狀的白色沉淀，輕輕地攪拌均勻。在酸度計上檢查最終pH值應(yīng)為大約3.5，若pH值偏離3.5±02則要用5molL氫氫化鈉或5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值，由于提取液非常稠，在調(diào)節(jié)pH值時防止局部過酸或過堿。pH值調(diào)好穩(wěn)定后，在室溫下靜置4h以上。待卵清清蛋白完全沉淀后，以3000rmin離心10min。棄去沉淀物，上清液用濾紙過濾，以除去上清液中脂類物質(zhì)及其他不溶物。收集濾液轉(zhuǎn)入500mL的燒杯內(nèi)。檢查濾液的pH值是否為3.5，否則要調(diào)回到pH3.5。置冰浴或冰箱內(nèi)冷卻片刻，緩慢加入3倍體積預(yù)冷的丙酮，用玻璃棒輕

7、輕攪勻，用塑料薄膜蓋好封嚴(yán)，在冰浴里放置24h，待雞卵類黏蛋白完全沉淀后，小心虹吸出一部分上清液，剩余的部分全部轉(zhuǎn)移到50mL帶蓋的離心杯里，加蓋經(jīng)平衡后以3000rmin離心15min，除去上清，沉淀物放在真空干燥器內(nèi)，抽氣除去殘留丙酮。使沉淀物由白轉(zhuǎn)變?yōu)橥该黟こ砦锖笸Ｖ钩闅?。加?0mL蒸餾水溶解，若溶解液混濁則用濾紙濾去不溶物。濾液經(jīng)SephadexG-25柱層析法脫鹽或者經(jīng)透析除鹽。2雞卵類黏蛋的脫鹽用SephadexG-25柱層析法脫鹽的操作如下： 稱取30gSephadexG-25，用500mL0.02molL，pH6.5的磷酸鹽緩沖液在100熱溶脹2h或者室溫下溶脹24h。脫氣后

8、裝柱(35mmx300mm)，柱床體積約150mL。用約2倍體積的0.02molL，pH6.5磷酸鹽緩沖液平衡。流出液在核酸蛋白質(zhì)檢測儀上繪出穩(wěn)定的基線或經(jīng)紫外分光光度計測定光吸收，其A280小于0.02即可上樣。取20mL雞卵類黏蛋白提取液上柱(上樣量不超過柱床體積的16)。用同樣的緩沖液洗脫，收集第一峰，在蛋白峰完全流出后鹽才開始流出，鹽通常在280nm無明顯光吸收，若繪出第二峰則是殘留丙酮峰。丙酮和鹽同時流出。洗脫曲線見下圖。12 3雞卵類黏蛋白的純化 通過上述方法獲得的雞卵類黏蛋白仍含有少量的卵清清蛋白。由于二者的等電點(diǎn)不同，采用DEAE-纖維素離子交換層析可以將二者分開。 稱取10g

9、 DEAE-纖維素粉(DE-32)，用150mL 0.5 molL氫氧化鈉-0.5mol/L氯化鈉溶液浸泡20min。用布氏漏斗(內(nèi)墊為200目尼龍網(wǎng))抽濾。用蒸餾水洗至pH80左右，抽干。然后移至500mL的燒杯內(nèi)，用150mL0.5molL鹽酸溶液浸泡20min，再轉(zhuǎn)移到布氏漏斗內(nèi)，抽濾，用蒸餾水洗至pH6.0左右，最后轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，用150mL0.2molL，pH6.5磷酸鹽緩沖液浸泡約15min，經(jīng)真空干燥器脫氣后裝柱。 取一支層析柱(35mmx200mm)裝入約14體積的0.02molL，pH6.5磷酸鹽緩沖液，將處理過的DEAE-纖維素裝入柱內(nèi)。以同一緩沖液平衡，流出液在核酸蛋白質(zhì)

10、檢測儀上繪出穩(wěn)定的基線或經(jīng)紫外分光光度計測定光吸收，待A280值小于0.02即可加樣。 將經(jīng)SephadexG-25脫鹽后的雞卵類黏蛋白溶液上柱吸附。以0.02molL,，pH65的磷酸鹽緩沖液平衡，基線穩(wěn)定后，改用0.3molL氯化鈉 0.2molL，pH6.5的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集第二洗脫峰。柱層析圖譜見上圖。在雞卵類黏蛋白液中所含的雞卵清清蛋白，在洗脫時可能出現(xiàn)一個小峰或不明顯的峰形。在這種情況下可根據(jù)峰形大小，測定活性來確定雞卵類黏蛋白洗脫峰的位置。 4.雞卵類黏蛋白純品的制備 經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱層析制得的雞卵類黏蛋白溶液裝入透析袋內(nèi)，用蒸餾水進(jìn)行透析，間隔一段時間更換一次

11、蒸餾水，直至經(jīng)1硝酸銀檢查無氯離子為止。將透析過的雞卵類黏蛋白溶液轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，小心地用1molL鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.0，取出lmL，稀釋510倍測定雞卵類黏蛋白的含量及活性。然后加入3倍體積的預(yù)冷丙酮，用塑料薄膜封嚴(yán)燒杯口，在冰浴里靜置4h左右。待雞卵類黏蛋白完全析出后，傾去上清，沉淀轉(zhuǎn)移到一個帶蓋的50mL離心杯內(nèi)，于3000rmin離心15min，棄上清，沉淀物放人真空干燥器內(nèi)干燥，即可得到透明膠狀物-雞卵類黏蛋白(約200300mg)。 5雞卵類黏蛋白的含量測定 配成一定濃度的雞卵類黏蛋白溶液，測定A280。雞卵類黏蛋白的消光系數(shù)是：A1%1cm=4.13。 雞卵類黏蛋白(mgmL)=(

12、A280稀釋倍數(shù))/0.413 6.雞卵類黏蛋白的活性測定 (選做) 雞卵類黏蛋白的活性可以用抑制胰蛋白酶的活力單位表示。即：抑制1個胰蛋白酶活力單位(BAEE單位)所需卵類黏蛋白量定為抑制劑的1個活力單位。 取2個石英比色池(帶蓋，光程為l cm)，一個加入0.05molL，pH80 Tris-HCl緩沖液和20molL，BAEE底物溶液各1.5mL混勻，在波長253nm處調(diào)整儀器零點(diǎn)。另一個比色池內(nèi)加0.05molL，pH8.0，Tris-HCl緩沖液1.5mL，10L胰蛋白酶液(約10g胰蛋白酶)，10L雞卵類黏蛋白(約5-10g雞卵類黏蛋白)輕輕搖勻，在室溫下(最好是在25恒溫箱內(nèi))放

13、置2min 如蛋白酶與雞卵類黏蛋白充分結(jié)合。然后加入2molL BAEE底物溶液15mL，立即混勻并記時。于波長253mn處測定其光吸收遞增值A(chǔ)253min。每隔30 s讀數(shù)一次，使A253min值控制在0.05左右為宜，否則要根據(jù)A253min的大小適當(dāng)減少或增加雞卵類黏蛋白的量。 以反應(yīng)時間t為橫坐標(biāo)，A253為縱坐標(biāo)作圖，取直線部分的任一時間間隔與相應(yīng)的光吸收變化值為A253min用A2表示。與此同時，以同樣的方法(不加雞卵類黏蛋白：測胰蛋白酶的活性。通過作圖得到光吸收變化值A(chǔ)253min，用A1表示。 雞卵類黏蛋白的抑制活性及抑制比活性的計算公式如下： 雞卵類黏蛋白的抑制活性單位(BAEE)=(Al-A2)/0.001 雞卵類黏蛋白抑制比活單位(BAEE單位/mg胰蛋白酶)=(Al-A2) 1000/（Al-A2）/I0.001 式中 Al：胰蛋白酶A253min；A2：加入抑制劑后胰蛋白酶A253min；I：