朊病毒的致病機(jī)理及其檢測(cè)

1、食品微生物學(xué)進(jìn)展課程論文食品微生物學(xué)進(jìn)展課程論文題 目：朊病毒的致病機(jī)理及其檢測(cè)姓 名：費(fèi)鵬學(xué) 號(hào)2011309110056專 業(yè)：糧食、油脂和植物蛋白工程指導(dǎo)教師：陳福生職 稱教授中國(guó)·武漢二一二 年 一 月朊病毒的致病機(jī)理及其檢測(cè)摘 要：朊病毒病是人和動(dòng)物的一種致死性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要包括羊騷癢病，瘋牛病，以及人的克雅氏綜合癥。其致病因子被認(rèn)為是一種由正常細(xì)胞PrP蛋白經(jīng)非正常折疊所形成的蛋白質(zhì)（PrPsc）。本文對(duì)其理化性狀、致病機(jī)理以及檢測(cè)方法加以綜述。關(guān)鍵詞：朊病毒；羊騷癢?。化偱２。豢搜攀暇C合癥；致病機(jī)理；Abstract：Prion diseases is a

2、family of fatal neurodegenerative disorders in both huma -ns and animals,including scrapie in sheep,Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) in cattle and Creutzfeld-Jakob Disease(CJD) in human.The pathogenic factor of these diseases is thought to be a abnormal isoform protein(PrPSc) of a normal cellu

3、lar protei -n-PrPC. In this review the present knowledge concerning the physico-chemical featur -es of prion, prion pathogenesis as well as detection method is presented.Keywords: prion; scrapie; BSE; CJD; pathogenesis; 朊病毒,也稱為朊粒，是一種只有蛋白質(zhì)而沒(méi)有核酸的傳染因子。它是動(dòng)物和人傳染性海綿狀腦?。═ransmissible Spongiform Encephloath

4、y, TSE）的主要致病因子。1982年P(guān)rusiner提出“唯蛋白”假說(shuō)，以后Weismann等人對(duì)其逐步完善，并成為目前的主流學(xué)說(shuō)。該假說(shuō)認(rèn)為：TSE是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的正常細(xì)胞PrP(Cellular Isoform of Prion Protein，PrPC)轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒缘漠惓０W病型PrP(Scrapie Isoform Of Prion Protein,PrPSc)所致。PrPSc在感染動(dòng)物腦內(nèi)形成不溶性的、抗蛋白酶的積聚物而引起動(dòng)物發(fā)病，1985年英國(guó)爆發(fā)瘋牛病后，朊病毒引起了人們的極大關(guān)注。而且隨著時(shí)間的推移和科研水平的提高，朊病毒蛋白的結(jié)構(gòu)特征、生化特性及致病機(jī)理的研究取

5、得了顯著進(jìn)展(刁小龍，2007）。由朊病毒引起的傳染性海綿狀腦病有在動(dòng)物中有羊瘙癢病(scrapie of sheep and goat)、水貂傳染性腦病(Transmissible Mink Encephalopathy，TME)、鹿慢性退行性變(Chronic Wasting Disease of Deer，CWD)、牛海綿狀腦病(Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE)以及貓海綿狀腦病(Feline Spongiform Encephalopathy，F(xiàn)SE)等。在人類中的疾病主要有庫(kù)魯病(Kuru disease)、克-雅病(Creutzfeld-Ja

6、kob Disease，CJD)、格斯特曼綜合征(Gretmann-Straussler Syndrome，GSS)、致死性家庭失眠癥(Fatal Familial Insomnia，F(xiàn)FI)、克-雅病變種(variant CJD，v-CJD)（侯佩強(qiáng)，2003）。一、朊病毒的發(fā)現(xiàn)及其特性1 朊病毒的發(fā)現(xiàn)早在200多年以前,英國(guó)的牧人就注意到羊的一種致死性疾病，即羊瘙癢病，但病因并不清楚（楊正，2011）。隨著技術(shù)的發(fā)展，這種病越來(lái)越被人們所注意。這種為了探究這種致病原的性質(zhì)，研究人員檢測(cè)了羊瘙癢病病腦勻漿對(duì)動(dòng)物的致病能力。發(fā)現(xiàn)感染因子可以通過(guò)濾器，有點(diǎn)象病毒，但與病毒不同，用福爾馬林處理不能

7、使之完全失活。1966年，英國(guó)放射生物學(xué)家Alper發(fā)現(xiàn)，這種物質(zhì)對(duì)254nm的紫外線照射不敏感，而對(duì)237nm的紫外線敏感。1972年，由于Prusiner的一位病人死于克雅氏病，促使他開(kāi)始研究這類疾病。經(jīng)過(guò)10年努力，Prusiner與其同事終于在1982年從倉(cāng)鼠腦中濃縮了羊搔癢病病原成分。這是一種直徑25nm長(zhǎng)約100200nm其濃縮成分的活性可被蛋白酶K，二乙酰焦碳酸、尿素、酚和SDS等破壞，但不能被核酸酶E或紫外線照射破壞。所以Prusiner稱之為Prion,意為蛋白性感染顆粒（Proteinaceous infectious particle）。這個(gè)成份中只含一種蛋白質(zhì)，稱為朊病

8、毒蛋白（prion protein，PrP），并命名為朊病毒（Virino）。 Prusiner因此獲1997年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。2 PrPC與PrPSc與細(xì)菌、真菌及病毒等病原體不同，prion是一種不含核酸的蛋白質(zhì)，普遍存在于人和動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)并由宿主自身基因編碼。正常的細(xì)胞型構(gòu)象PrPC沒(méi)有致病性, 但在一定的條件下可以轉(zhuǎn)化成瘙癢型PrPSc這種異常構(gòu)象，從而引起傳染 性海綿狀腦病的發(fā)生。PrPC和 PrPSc雖然具有完全相同的一級(jí)序列，但因構(gòu)象上的差異導(dǎo)致生化性質(zhì)顯著不同：PrPC是可溶的單體，以螺旋為主，易被蛋白水解酶K降解；PrPSc高度不溶，折疊含量高，極易形成抗蛋白酶K水解的多

9、聚體（林東海，2011）。PrP的構(gòu)象變化造成了其理化和生化性質(zhì)的顯著變化。3 PrPSc理化性質(zhì)及生化特性3.1 PrPSc獨(dú)特的理化性質(zhì) 高壓蒸汽滅菌（134138）18 分鐘不能使其完全滅活。 對(duì)紫外線（波長(zhǎng) 254nm）照射的抵抗力比一般的病毒高 40200 倍，但是對(duì) 237nm的紫外線敏感（白麗榮，1999）。 對(duì)一般的離子輻射和超聲波抵抗力很強(qiáng)。 對(duì)許多微生物有致死作用的一般化學(xué)消毒劑對(duì)朊病毒卻無(wú)法起到坡壞作用，如37的20%的福爾馬林溶液中可存活28個(gè)月。 對(duì)多種核酸酶（RNA 酶和 DNA 酶）有抵抗作用，但可以被胰蛋白酶降解。這一點(diǎn)也證明了朊蛋白中不含有核酸。 一些蛋白質(zhì)變

10、性劑或氨基酸化學(xué)修飾劑對(duì)其具有滅活或抑制作用，如尿素、SDS 等處理則使其失去活性。3.2 PrPSc獨(dú)特的生化特性 不形成包涵體，不含非宿主蛋白，不誘生干擾素，對(duì)干擾素也不敏感，不干擾其他病毒誘生干擾素，也不受普通病毒干擾。 不破壞宿主B細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫功能，也不引起宿主的免疫反應(yīng)。 在電鏡下見(jiàn)不到其病原顆粒，但可檢測(cè)出癢病相關(guān)纖維（Sceapre Associate Fibrils，SAF） 朊蛋白病毒一旦致病，免疫增強(qiáng)劑和免疫抑制劑均不能改變致病過(guò)程。 朊蛋白病毒（PrPSc）在溫和的清潔提取物中大量聚合成癢病相關(guān)纖維（SAF）或短桿結(jié)構(gòu)，即在非變性去污劑中不溶，而細(xì)胞朊蛋白（PrPC

11、）則可以完全溶于其中，只以單體或是二聚體形式存在，故用核磁共振（NMR）和X光譜分析就可以檢測(cè)到PrPC的三維構(gòu)象，卻不能辨別PrPSc的構(gòu)象。 PrPSc具有相對(duì)的抗蛋白酶水解特性，如在用蛋白酶K進(jìn)行水解時(shí)，PrPSc只被水解掉其N-端的67個(gè)氨基酸殘基，形成PrP2730，成為其致病的“無(wú)敵先鋒”。而PrPC則可被完全水解掉，故PrPSc的半衰期特別長(zhǎng)，而PrPC的半衰期短（楊建民，2004）。 PrPSc和PrPC都依賴于磷酸肌醇磷脂酶結(jié)合位點(diǎn)（GPI）附著在細(xì)胞表面，經(jīng)過(guò)磷酸肌醇磷脂酶C（PUPLC）酶解后，PrPSc不能從膜上釋放，而PrPC則可以。用Trion X-114進(jìn)行相分離

12、后，PrPC處于水相。而PrPSc則處于Trion X-114 相中。 用特異的抗體與朊蛋白反應(yīng)，PrPSc有血清反應(yīng)，而PrPC則沒(méi)有反應(yīng)。說(shuō)明兩者的高級(jí)結(jié)構(gòu)是不同的。二、PrPSc的致病機(jī)理和轉(zhuǎn)化1 阮病毒的致病機(jī)理關(guān)于朊病毒的致病機(jī)理，主要有兩種觀點(diǎn)。一個(gè)是由于PrPC正常功能的缺失，另一個(gè)是由于PrPSc的過(guò)度增殖而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。除此之外，還有擬病毒假說(shuō)與聯(lián)合假說(shuō)等等。1.1 PrPC正常功能的缺失 PrPC的編碼基因在小鼠中位于2號(hào)染色體,在人類位于20號(hào)染色體。PrPC在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞、白細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)。關(guān)于PrPC生理功能的研究進(jìn)展較為緩慢，目前發(fā)

13、現(xiàn)其可能在神經(jīng)系統(tǒng)、T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及核酸代謝等方面發(fā)揮一定作用（王小凡，2005）。1.2 PrPSc的神經(jīng)毒性 PrPSc具有潛在的神經(jīng)毒性，其中PrP106-126稱為神經(jīng)肽，單獨(dú)這一段小肽也能使在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。而大量PrPSc在CNS尤其是在腦內(nèi)的積累可抑制Cu2+與SOD或其它酶的結(jié)合，從而使神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化作用下降，PrPSc還可抑制星形細(xì)胞攝入能誘導(dǎo)其增殖的Glu。此外，細(xì)胞內(nèi)的PrPSc可能還抑制tau調(diào)節(jié)的微管蛋白的聚合,導(dǎo)致L-型鈣通道發(fā)生改變，進(jìn)而使細(xì)胞骨架失去穩(wěn)定性，最終都可使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡并形成空泡狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使各種信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生紊亂。外在表現(xiàn)為自主運(yùn)動(dòng)失

14、調(diào)、恐懼、生物鐘紊亂等癥狀（喬俊文，2006）。1.3 酵母菌朊病毒假說(shuō) Cox(1965)發(fā)現(xiàn)在某些酵母菌株內(nèi)存在一種引起終止密碼抑制的成分，表現(xiàn)為顯性，且不遵守孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，故命名為PSI+。Lacrout發(fā)現(xiàn)某些釀酒酵母菌中存在另外一種非孟德?tīng)柍煞?，與PSI+具有相似的遺傳特性，該成分被命名為URE3。Wickner提出用酵母菌朊病毒假說(shuō)來(lái)解釋PSI+和URE3的遺傳行為。認(rèn)為PSI+和URE3可能和朊病毒一樣，是由細(xì)胞內(nèi)正常成分Sup35和Ure2P經(jīng)構(gòu)型改變而來(lái)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的C端失去其正常功能，所以能產(chǎn)生Sup35和Ure2P突變相同的表現(xiàn)型；失去正常結(jié)構(gòu)和功能的Sup35和Ure

15、2P又可與新的Sup35和Ure2P相互作用，誘導(dǎo)他們發(fā)生同樣的構(gòu)型改變，從而使PSI+和URE3表現(xiàn)出顯性且不遵守孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。因此，將PSI+和URE3稱為酵母菌朊病毒(yeast prion)。與哺乳動(dòng)物朊病毒不同的是：PSI+和URE3不在細(xì)胞間傳播，而是由細(xì)胞母代傳給子代；也不會(huì)導(dǎo)致其存在的細(xì)胞發(fā)生死亡,而是使其產(chǎn)生新的細(xì)胞代謝型。因此,對(duì)于哺乳動(dòng)物和人類，朊病毒是一種致病因子，對(duì)于酵母菌，則可視作一類可遺傳的代謝表現(xiàn)型決定因子。1.4 擬病毒假說(shuō) Dickinson和Outran首次提出,后由Kimberlin闡述。擬病毒假說(shuō)即核蛋白論，認(rèn)為TSEs病原因子是擬病毒,由蛋白質(zhì)和核

16、酸組成。核酸由宿主酶催化復(fù)制,不編碼病原因子的蛋白質(zhì)，但其必需成分與宿主成分(如PrPSc)緊密結(jié)合，并受其保護(hù)。病原因子蛋白質(zhì)由宿主基因組編碼，并形成核酸的外被，但至今未能證實(shí)TSEs病原因子有特異性核酸(Bruce，1997)。1.5 聯(lián)合學(xué)說(shuō) Weissmann認(rèn)為感染因子是完全朊病毒(holoprion)，它由2種成分組成：一種是分離朊病毒(apoprion)，即PrPSc，由宿主基因組復(fù)制，本身就可致?。涣硪环N是協(xié)同朊病毒(coprion)，即核酸，它決定毒株的株特異性。這種核酸可能連結(jié)于PrPSc上,也存在于正常宿主細(xì)胞中。PrPSc單獨(dú)侵入細(xì)胞后，可激活某種細(xì)胞核酸,使其呈現(xiàn)協(xié)同

17、朊病毒的作用。協(xié)同朊病毒借助細(xì)胞正常的聚合酶復(fù)制，這一過(guò)程由PrPSc激發(fā)，且可能依賴于PrPSc的存在。這一假說(shuō)實(shí)際上是朊病毒假說(shuō)和擬病毒假說(shuō)的綜合，使該病原因子的結(jié)構(gòu)理論更趨完善，頗具吸引力,但目前還沒(méi)有可靠的試驗(yàn)證據(jù)(Hornemann，1997)。2 PrPSc的形成和蓄積無(wú)論P(yáng)rPSc致病機(jī)理是什么，其致病的第一步都是PrPSc的形成過(guò)程和蓄積。PrPSc是由PrPC經(jīng)過(guò)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變形成的。關(guān)于這一過(guò)程目前主要有兩種模型來(lái)解釋：2.1 重折疊模型PrPC作為許多動(dòng)物體的正常代謝的一部分，被不斷的合成和降解。但因PrPC結(jié)構(gòu)的隨機(jī)不穩(wěn)性，能產(chǎn)生極少數(shù)部分未折疊的單體結(jié)構(gòu)，稱為PrP*。P

18、rP*是形成PrPSc的中間體。它既能形成兩種不同構(gòu)象的PrP蛋白，即PrPC和PrPSc，也可能和PrPSc形成暫時(shí)性的復(fù)合物（PrP*PrPSc）（黃銀霞，2006）。然后再轉(zhuǎn)化為兩分子的PrPSc。這個(gè)過(guò)程的發(fā)生會(huì)使PrPSc呈指數(shù)性增長(zhǎng)。正常情況下PrP*的濃度很低，PrPSc的形成亦可以忽略不計(jì)，但當(dāng)出現(xiàn)以下三種情況時(shí)，PrPSc便會(huì)大量地產(chǎn)生和積蓄： 在發(fā)生傳染性朊病毒病時(shí)，外源的朊病毒進(jìn)入細(xì)胞，并作為模板促使PrP*轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc；在散發(fā)性朊病毒病中，外源的朊病毒參與，可能是由于PrP*積蓄至足以自發(fā)產(chǎn)生PrPSc的水平，再通過(guò)正反饋環(huán)道促使PrP*轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc，但這種情況

19、通常很少發(fā)生；另一方面，體細(xì)胞突變也可使PrPC失穩(wěn)促使PrP*轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc；在發(fā)生遺傳朊病毒時(shí)，突變的PrPC（PrPC）作為許多細(xì)胞正常代謝的一部分被合成和降解。PrPC的隨機(jī)不穩(wěn)定性比PrPC高，從而產(chǎn)生部分解折疊的單體結(jié)構(gòu)PrPC，他和PrP*一樣，能重新變?yōu)镻rPC被降解，也可轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc，PrPSc一旦形成即通過(guò)正反饋環(huán)道促使PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc（史懷平，2004）。2.2 種子模型 低分子量的PrPSc聚合物充當(dāng)種子。當(dāng)沒(méi)有種子時(shí)，PrPC和PrPSc單體間發(fā)生快速的可逆的構(gòu)象變化。但PrPC單體構(gòu)象比PrPSc穩(wěn)定，因此占主要組分。當(dāng)種子存在時(shí)它可以通過(guò)與PrPSc

20、單體形成穩(wěn)定PrPSc構(gòu)象，加速PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc，而且此過(guò)程是不可逆的（馬秀芳，2002）。這一模型能解釋朊病毒潛伏期較長(zhǎng)的現(xiàn)象。需要指出的是上述兩種模型并不是相互排斥的，在朊病毒增殖過(guò)程中有可能是兩種模型同時(shí)起作用。另外，Yelling等人在后來(lái)的研究中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)人PrP基因的小鼠不能感染人類的朊病毒，而表達(dá)人鼠嵌合PrP的轉(zhuǎn)基因小鼠則能被感染，據(jù)此他們認(rèn)為僅PrPSc本身還不足以誘導(dǎo)PrPC構(gòu)象改變，還需要一種輔助因子，他們稱之為“蛋白”（林海，2002）。Kaneko等人提供了新的證據(jù), 表明在 PrPSc的增殖過(guò)程中, 需要 X 蛋白結(jié)合到 PrPC的一個(gè)不連續(xù)表位,

21、包括殘基167、171、214 和218四個(gè)位點(diǎn), 否則 PrPSc的轉(zhuǎn)化將受到抑制?！暗鞍住笔怯尚∈蠓荘rP基因編碼的特異因子，可能是參與催化PrPC分子構(gòu)象改變的“分子伴侶”，同PrPC和PrPSc形成三元復(fù)合物?！暗鞍住钡陌l(fā)現(xiàn)證明在PrPC向PrPSc轉(zhuǎn)變的過(guò)程中還需要一些輔助因子參與。由于 X 蛋白可以通過(guò)與PrPC的結(jié)合來(lái)調(diào)控prion的構(gòu)象轉(zhuǎn)化, 所以許多實(shí)驗(yàn)室都在努力尋找X蛋白。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多能與PrPC發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)比如小鼠STLI、Synapsin、Grb 2、Pint 1、B-crystalline(Sun G，2005)和tetraspanin-7等。這些潛在的

22、X蛋白是否真正具有轉(zhuǎn)化因子的特性,還需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。值得一提的是，在體內(nèi)廣泛存在的熱休克蛋白家族中，Hsp104和Hsp70似乎都能與PrPC發(fā)生相互作用, 然而，前者引起prion向抗蛋白酶K水解的狀態(tài)轉(zhuǎn)化，后者則對(duì)類似PrPSc形式的聚集有抑制作用。Prion構(gòu)象轉(zhuǎn)變過(guò)程中或許存在著一種平衡調(diào)控或反饋機(jī)制。三、阮病毒的檢測(cè)方法1 動(dòng)物接種試驗(yàn)動(dòng)物傳遞實(shí)驗(yàn)是早期判斷生物體是否感染朊病毒、研究朊病毒傳染性的主要手段，其敏感度較高,但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的許多功能已被更快捷、更準(zhǔn)確的方法所代替,但作為生物學(xué)方法仍然是研究朊病毒不可缺少的重要環(huán)節(jié)(Kretzschm

23、ar等,1996)。目前常用的朊病毒試驗(yàn)動(dòng)物包括小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。常規(guī)試驗(yàn)操作是將無(wú)菌組織標(biāo)本勻漿后連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度從對(duì)側(cè)眼角與耳上緣連線的中點(diǎn)處接種于試驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)，接種后24 h內(nèi)死亡的視為機(jī)械性死亡，應(yīng)該補(bǔ)接，以后正常飼養(yǎng)，每日觀察癥狀，注意出現(xiàn)興奮、沉郁、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀的時(shí)間，出現(xiàn)上述癥狀的動(dòng)物應(yīng)立即撲殺，取腦組織做組織病理學(xué)和免疫學(xué)檢查，確定其是否感染朊病毒，根據(jù)動(dòng)物發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)計(jì)算滴度。2 組織病理學(xué)檢測(cè)方法朊病毒感染后引起神經(jīng)元空泡化、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、產(chǎn)生淀粉樣蛋白斑塊等，同時(shí)病變主要集中在大腦皮質(zhì)部位、海馬以及小腦等。在病灶中蛋白纖維呈放射狀排列，大腦皮質(zhì)可見(jiàn)神經(jīng)纖維

24、節(jié)，電鏡觀察在淀粉樣病變區(qū)可見(jiàn)纖維樣蛋白結(jié)構(gòu)成簇交叉排列，這就是所謂的羊癢病相關(guān)纖維(SAF)。組織病理學(xué)檢測(cè)方法主要是通過(guò)檢測(cè)羊癢病相關(guān)纖維(SAF)和神經(jīng)元空泡化變性來(lái)診斷朊病毒的一種方法，也是檢測(cè)朊病毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法之一。檢查樣本在10%福爾馬林中固定約35d，經(jīng)常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察其病變的特征表現(xiàn)，這是判定朊病毒的有力依據(jù)之一。還可以通過(guò)電鏡觀察腦組織勻漿中的特征性相關(guān)纖維的存在。電鏡法的基本步驟包括：將被檢組織勻漿、差速離心、PK消化、重懸、復(fù)染，然后電鏡觀察，但是電鏡法靈敏度較低。3 免疫學(xué)檢測(cè)方法3.1 免疫組織化學(xué)方法（immunohistochemical） 免疫組

25、織化學(xué)檢測(cè)方法是一種特異性高、敏感性強(qiáng)的診斷朊病毒的方法，其是利用特異性的抗體對(duì)組織病理切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)結(jié)果也是確診朊病毒的重要依據(jù)。這種檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)單，且特異性較高，可以在經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋的組織標(biāo)本制成的組織切片上直接進(jìn)行。此法依賴于經(jīng)蛋白酶K消化以及特異性抗體檢測(cè)后，觀察是否有大小顆粒不等的棕黃色淀粉樣物質(zhì)堆積即PrPSc沉積，基本步驟：組織塊預(yù)處理，然后依次是蛋白酶K消化以及特異性抗體和酶標(biāo)二抗孵育，再加底物顯色，鏡檢。此外有研究結(jié)果表明，由于朊病毒體內(nèi)蓄積速度慢，且甲醛固定、石蠟包埋等處理后，大大削弱了朊病毒的免疫反應(yīng)性，使用蟻酸對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，大大提高了免疫組化

26、的靈敏度，染色效果也得到改善(Kitamoto等，1987)。也Van Everbroeck等(1999)對(duì)各種預(yù)處理方法進(jìn)行試驗(yàn),優(yōu)化了一種以恢復(fù)被破壞的抗原表位的方法，該法修復(fù)被福爾馬林破壞的抗原表位效果最好，染色結(jié)果也最好。3.2 免疫印跡法(Western blotting)免疫印跡法是目前OIE公認(rèn)的用于確診瘋牛病的方法之一。該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、所用材料少的特點(diǎn)。PrPSc具有部分抵抗蛋白酶K消化的能力PrPC又可被蛋白酶K消化，所以免疫印跡法就是利用PrPSc的這一特性對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的。免疫印跡的基本步驟：腦組織樣品經(jīng)勻漿處理后，在適當(dāng)條件下經(jīng)蛋白酶消化，除去腦組織中PrP

27、C，變性處理后電泳，將腦組織中的不同蛋白質(zhì)分開(kāi)，而后通過(guò)電轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，分別用單克隆抗體和酶標(biāo)二抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，最后用化學(xué)發(fā)光底物結(jié)合底片曝光進(jìn)行顯示。正常動(dòng)物腦勻漿經(jīng)蛋白酶K消化后無(wú)條帶出現(xiàn)，而未消化的正常腦勻漿在底片上可以顯示3條條帶，分子質(zhì)量在2535 ku之間；但朊病毒感染的腦勻漿經(jīng)蛋白酶K消化后有2條具有蛋白酶K抗性的陽(yáng)性條帶出現(xiàn)，分子質(zhì)量約2531ku。免疫印跡法操作簡(jiǎn)單，而且可以顯示不同的PrPSc類型，還可以從臨床前期的淋巴組織器官提取物中檢測(cè)到PrPSc，從而進(jìn)行早期的臨床診斷，但是操作較困難。該法樣本用量較大，離心需要時(shí)間長(zhǎng)，所以不適合常規(guī)的朊病毒檢測(cè)，更不

28、適合大批量樣本的篩查。為了解決這些難題。Lee等(2000)建立了一種檢測(cè)方法，靈敏度達(dá)510 pg的PrPSc，可檢測(cè)出1020 ng倉(cāng)鼠腦組織中的朊病毒，并且有較好的重復(fù)性。3.3 組織印跡法(Histoblot)組織印跡技術(shù)是將靈敏的蛋白檢測(cè)技術(shù)和解剖學(xué)組織保存技術(shù)結(jié)合，檢測(cè)組織中微量PrPSc的方法。該方法不僅靈敏度高，特異性強(qiáng),而且大大簡(jiǎn)化了操作程序，對(duì)朊病毒的檢測(cè)更加快速、簡(jiǎn)單，已被廣泛應(yīng)用于朊病毒的研究?；静襟E：切取冰凍切片、轉(zhuǎn)入預(yù)濕的硝酸纖維素膜上、空氣干燥、PK消化、鹽酸胍處理、漂洗NC膜，最后進(jìn)行免疫檢測(cè)。但是普通組織印跡的一個(gè)明顯缺點(diǎn)是必須使用未經(jīng)固定的組織標(biāo)本，而大多

29、數(shù)常規(guī)的病理學(xué)標(biāo)本都是經(jīng)福爾馬林固定的，普通組織印記方法不能對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。為了解決這一難題，Schulz-Schaeffer(2000)等建立了一種石蠟包埋的組織印跡技術(shù)(PET-blot)，該法不僅擴(kuò)大了組織標(biāo)本的檢測(cè)范圍，而且保留了組織印跡技術(shù)原有的優(yōu)點(diǎn)，可以檢測(cè)福爾馬林固定、石蠟包埋過(guò)的組織標(biāo)本，在形態(tài)學(xué)分析方面優(yōu)于普通組織印跡，但在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平上的微觀分析方面不如傳統(tǒng)的免疫組化。3.4斑點(diǎn)印跡法(Dot-Blot) 斑點(diǎn)印跡法是由Serban等提出，其靈敏度較低，但是操作簡(jiǎn)單，而且對(duì)儀器設(shè)備要求低,適合大批量樣本的篩查?；静襟E是將組織樣本置于冷的裂解緩沖液中勻漿，然后經(jīng)離心去除不

30、溶性殘?jiān)瑢⑸锨逡号c含SDS樣本緩沖液等量混合,混合液點(diǎn)樣于干燥的NC膜上，經(jīng)空氣干燥、PK消化、硫氰酸胍處理、封閉，最后進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，并且該法可定量，適合大批量樣本普查篩選工作。目前用于檢測(cè)朊病毒的ELISA方法分為間接法和雙抗夾心法兩種。間接法是先將從各個(gè)標(biāo)本中提取的PrPSc分別包被于酶標(biāo)板孔中，然后依次加入特異性一抗、酶標(biāo)二抗，最后加底物顯色，酶標(biāo)儀讀板；雙抗夾心法是先用特異性抗體包被酶標(biāo)板，再加入標(biāo)本提取物，37孵育，然后加入特異性一抗、酶標(biāo)二抗，最后加底物顯色，酶標(biāo)儀讀板(Matsui，2011)。從

31、準(zhǔn)確程度上來(lái)看，免疫組化和免疫轉(zhuǎn)印的結(jié)果與真實(shí)情況的符合率都達(dá)到100%，而且結(jié)果明確、易于判斷,相對(duì)來(lái)說(shuō)ELISA法稍差，其結(jié)果要經(jīng)過(guò)細(xì)致分析和數(shù)據(jù)處理才能作出判斷(王志亮等，2001)。4 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增(protein misfolding cyclic amplification，PMCA)技術(shù)是一種模擬體內(nèi)PrPC轉(zhuǎn)為PrPSc的體外試驗(yàn)方法，它類似于PCR的體外擴(kuò)增PrPSc的方法。PMCA技術(shù)通過(guò)將PrPSc和PrPC混合物在體外試管內(nèi)進(jìn)行大量的超聲循環(huán)和孵育，使得PrPSc通過(guò)與正常的PrPC相互作用促使PrPC通過(guò)構(gòu)象改變轉(zhuǎn)變成PrPSc，從而實(shí)

32、現(xiàn)自身的擴(kuò)增和復(fù)制(Saborio等，2001)。經(jīng)過(guò)超聲波破碎后使PrPSc凝集物破碎形成許多小的PrPSc單位，以這些小單位的PrPSc為“模板”，PrPC為“底物”通過(guò)反復(fù)循環(huán)，使PrPSc獲得大量的擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)在體外模擬體內(nèi)PrPC轉(zhuǎn)變成PrPSc復(fù)制擴(kuò)增的過(guò)程。該技術(shù)的建立有助于研究Prion構(gòu)象轉(zhuǎn)變的機(jī)制，也是目前對(duì)Prion疾病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)最靈敏的方法。5 毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)是近十幾年發(fā)展較快的一種高效快速的分離分析技術(shù)。毛細(xì)管電泳技術(shù)是以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)樣品中各組分之間遷移速度和分

33、配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。由于PrPSc在感染動(dòng)物的血液中含量非常低，應(yīng)用一般檢測(cè)方法靈敏度不足，同時(shí)這些方法也只適用于尸檢，但CE相對(duì)于其它檢測(cè)方式的優(yōu)點(diǎn)在于它可以通過(guò)檢測(cè)血液中PrPSc實(shí)現(xiàn)活體檢測(cè)，避免大量屠宰健康動(dòng)物和疾病傳播，從而可以節(jié)約大量資金和防止與人類之間的交叉感染。應(yīng)用較多的是結(jié)合免疫熒光技術(shù)的毛細(xì)管電泳檢測(cè)法，該方法是根據(jù)免疫競(jìng)爭(zhēng)原理，將無(wú)區(qū)帶毛細(xì)管電泳技術(shù)與免疫熒光技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)而檢測(cè)標(biāo)本中的微量PrPSc?；驹硎菍⑷斯ず铣傻腜rPSc特異性肽鏈標(biāo)記上熒光，與一定量的特異性抗體、羊腦提取物電泳，當(dāng)抗體與熒光標(biāo)記的肽鏈結(jié)合時(shí),遷移率會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，從而

34、與游離的標(biāo)記肽鏈分離開(kāi)來(lái)，當(dāng)羊腦提取物中存在微量的PrPSc，PrPSc會(huì)與標(biāo)記肽鏈競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗體，導(dǎo)致結(jié)合型肽鏈與游離型肽鏈比例發(fā)生改變，從而被檢測(cè)出來(lái)。此方法能檢測(cè)到135pg的PrPSc，有很高的靈敏度，可用于檢測(cè)朊病毒水平含量較低的組織。6 雙色強(qiáng)熒光目標(biāo)掃描法雙色強(qiáng)熒光目標(biāo)掃描法可用來(lái)檢測(cè)極微量的朊病毒?；驹硎沁\(yùn)用共聚焦雙色熒光相關(guān)分光鏡技術(shù)，利用致病性PrPSc在適當(dāng)條件下自我復(fù)制和自發(fā)聚集的特點(diǎn),將重組PrP標(biāo)記上綠色熒光，PrPSc與正常構(gòu)象的PrP結(jié)合,通過(guò)變構(gòu)復(fù)制出大量異常構(gòu)象的PrP，由于PrPSc在一定條件下可自發(fā)聚集,從而使PrPSc周圍聚集大量的PrP，使其熒光

35、強(qiáng)度大大增加，同時(shí)又加入了能增強(qiáng)試驗(yàn)特異性的標(biāo)記上紅色熒光的特異性單抗,使聚集體又標(biāo)記上紅色熒光。只有同時(shí)發(fā)出高強(qiáng)度紅、綠熒光的顆粒，才能被檢測(cè)儀器檢測(cè)到。該方法靈敏度高、特異性好，可用于區(qū)別其他的朊病毒。四、結(jié)語(yǔ)盡管人們?cè)谶^(guò)去的幾十年里就朊病毒致病機(jī)理方面做了不懈的努力探索，同時(shí)在諸多領(lǐng)域取得了一些進(jìn)展，如朊蛋白的正常生理功能、朊病毒的傳播途徑及正常朊蛋白向異常朊蛋白空間構(gòu)象轉(zhuǎn)化機(jī)理方面等，然而還有很多的問(wèn)題沒(méi)有答案，如PrPSc是朊病中的致病因子還是病理產(chǎn)物，免疫系統(tǒng)為何不能識(shí)別體內(nèi)不同構(gòu)象的2種朊蛋白，體外試驗(yàn)產(chǎn)生的PrPSc無(wú)感染性的機(jī)理。對(duì)于“唯蛋白”假說(shuō)仍需要進(jìn)一步研究與探討。在實(shí)

36、際應(yīng)用中，進(jìn)一步揭示朊病毒疾病的機(jī)理，可以使我們更有效地認(rèn)識(shí)朊病毒疾病，進(jìn)而有效地預(yù)防、控制和治療朊病毒病。迄今為止,還沒(méi)有建立一種快速、敏感的檢測(cè)和診斷程序,對(duì)于朊病毒病的防制也僅限于預(yù)防而非治療。參考文獻(xiàn)1刁小龍，徐志良，邊靜靜等.朊病毒特性與致病機(jī)理研究進(jìn)展中國(guó)科技論文在線，.2侯佩強(qiáng)，田承業(yè)，李克利朊病毒及朊病毒病J上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2003，15(1)：25-273楊正，武建國(guó)朊病毒的檢測(cè)方法J醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2011(14)：60-654林東海，文 袆朊病毒蛋白prion的研究進(jìn)展J中國(guó)科學(xué)，2011，41(4)：683-6985白麗榮蛋白粒子病病原體朊病毒J衡水師專學(xué)報(bào)，1999

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