賀敏碩士研究生開(kāi)題報(bào)告

1、歡迎各位老師、同學(xué)廣西醫(yī)科大學(xué)碩 士 研究生學(xué)位論文開(kāi)題報(bào)告 課題名稱：課題名稱：利福平對(duì)醋氨酚肝毒性的保利福平對(duì)醋氨酚肝毒性的保 護(hù)作用和機(jī)制護(hù)作用和機(jī)制 研究生姓名：研究生姓名： 賀敏賀敏 導(dǎo)師姓名：導(dǎo)師姓名： 黃仁彬黃仁彬研究?jī)?nèi)容、意義和預(yù)期結(jié)果 w 通過(guò)體外小鼠肝微粒體溫孵法和高效液相色譜法等研究利福平對(duì)醋氨酚肝毒性的影響，觀察醋氨酚、利福平、谷胱甘肽在不同條件下體外鼠微粒體溫孵中含量的變化，以及新的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、酶學(xué)等技術(shù)進(jìn)一步探討利福平的保護(hù)作用機(jī)制。w 國(guó)內(nèi)外對(duì)利福平對(duì)醋氨酚肝毒性的影響的研究較少，本次實(shí)驗(yàn)主要從分子水平研究，進(jìn)一步明確利福平對(duì)醋氨酚肝毒性的保護(hù)作

2、用機(jī)制和機(jī)理，更好的了解利福平對(duì)醋氨酚肝毒性的保護(hù)作用。研究背景w 1 醋氨酚是常用的解熱鎮(zhèn)痛劑,其小劑量、短期服用，即使在有肝病的患者中，也無(wú)明顯的毒副作用，而在大劑量或長(zhǎng)期使用時(shí)，?？蓪?dǎo)致嚴(yán)重的毒性作用 。w 2 國(guó)內(nèi)外已闡明小部分的醋氨酚由肝臟內(nèi)細(xì)胞色素p450混合功能氧化酶代謝成n-乙酰-對(duì)苯醌亞胺（napqi），napqi能迅速和谷胱甘肽結(jié)合成谷胱甘肽-napqi復(fù)合體生成硫醚氨酸最終由尿液和膽汁中排泄而解毒?；蛘咄ㄟ^(guò)谷胱甘肽依賴的還原反應(yīng)而重新生成醋氨酚或n-羥基對(duì)乙酰氨基酚，在毒性劑量（一次服用50mg/kg）時(shí)，由于大量的napqi的產(chǎn)生，致使谷胱甘肽耗竭，大量的napqi與肝

3、細(xì)胞的許多重要的生物大分子結(jié)合，導(dǎo)致肝細(xì)胞功能紊亂。 研究背景研究背景w 3 一些服用肝細(xì)胞色素p450誘導(dǎo)劑如苯巴比妥都能增加醋氨酚的毒性，一些肝細(xì)胞色素p450抑制劑如西米替丁及谷胱甘肽提供體如半胱氨酸能減輕醋氨酚的毒性效應(yīng)。w 4 廣西醫(yī)科大學(xué)黃仁彬教授在世界首次發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞色素p450誘導(dǎo)劑利福平卻能減輕醋氨酚的谷胱甘肽耗竭作用 。研究目標(biāo)與內(nèi)容研究目標(biāo)與內(nèi)容 w 通過(guò)體外小鼠肝微粒體溫孵體外法和高效液相色譜法等研究利福平對(duì)醋氨酚肝毒性的影響，觀察醋氨酚、利福平、谷胱甘肽在不同條件下體外鼠微粒體溫孵中含量的變化，以及新的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)研究利福平對(duì)醋氨酚中毒引發(fā)的肝細(xì)胞損傷

4、的保護(hù)作用。通過(guò)酶學(xué)客觀反映利福平對(duì)肝內(nèi)代謝酶如gst的影響。利福平對(duì)肝臟cyp2e1cyp2e1表達(dá)的作用的研究及對(duì)醋氨酚中毒引起的細(xì)胞dna損傷的作用的研究。 擬采用的研究方法、關(guān)鍵技擬采用的研究方法、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)及解決途徑術(shù)指標(biāo)及解決途徑 w 一一 體外實(shí)驗(yàn)體外實(shí)驗(yàn)w 小鼠肝微粒體制備：用冰冷的生理鹽水從肝門靜脈或動(dòng)脈沖洗肝至陶土色，按重量體積比1:3加入冰冷的50 mm的pbs-20%甘油溶液，冰浴勻漿，取肝勻漿分別用高速離心機(jī)9000g和超速離心機(jī)40000轉(zhuǎn)(約100000g) 差速離心，取粉紅色沉淀用冰冷的50 mm的pbs-甘油冰浴懸浮，用雙縮脲法測(cè)定蛋白，稀釋成2mg/ml，

5、-80保存。測(cè)定p450和b5含量按資料進(jìn)行。 擬采用的研究方法、關(guān)鍵技擬采用的研究方法、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)及解決途徑術(shù)指標(biāo)及解決途徑w 體外小鼠肝微粒體溫孵法：保持肝細(xì)胞色素p450的高含量和高活性，確保藥物在孵育中能進(jìn)行代謝。加入一定的催化劑進(jìn)行催化。擬采用的研究方法、關(guān)鍵技擬采用的研究方法、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)及解決途徑術(shù)指標(biāo)及解決途徑w 1 首先建立醋氨酚、利福平和gsh及其相關(guān)代謝產(chǎn)物在酶系統(tǒng)中的hplc檢測(cè)方法，考察方法學(xué)。w 2 先考察apap和rfp在體外pbs中是否有相互作用。擬采用的研究方法、關(guān)鍵技擬采用的研究方法、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)及解決途徑術(shù)指標(biāo)及解決途徑w 3 建立和優(yōu)化體外肝p450

6、酶系統(tǒng)，指標(biāo)是醋氨酚在這個(gè)酶系統(tǒng)中有代謝即醋氨酚母體的濃度下降，且在這個(gè)系統(tǒng)中g(shù)sh的濃度比對(duì)照組明顯下降，表明有napqi的產(chǎn)生。napqi是無(wú)法檢測(cè)到的，因?yàn)樗划a(chǎn)生就和gsh或蛋白結(jié)合。只能通過(guò)gsh耗竭反映napqi的水平。擬采用的研究方法、關(guān)鍵技擬采用的研究方法、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)及解決途徑術(shù)指標(biāo)及解決途徑 4 建立了酶系統(tǒng)和檢測(cè)方法后，再加入利福平等物質(zhì)在不同體系、不同的濃度、不同的時(shí)間觀察三者及其代謝產(chǎn)物如的量的變化，另外還觀察一些氧化產(chǎn)物如gssg及醌式利福平的變化等，由它們量的變化關(guān)系總結(jié)規(guī)律，得出結(jié)論。 擬采用的研究方法、關(guān)鍵技擬采用的研究方法、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)及解決途徑術(shù)指標(biāo)及解決

7、途徑w 5 有能力有條件就找出利福平和napqi的結(jié)合產(chǎn)物。w 6 重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)次，考察結(jié)果的準(zhǔn)確性。 7 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果再進(jìn)行下一步的探索。 擬采用的研究方法、關(guān)鍵技擬采用的研究方法、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)及解決途徑術(shù)指標(biāo)及解決途徑w 二：細(xì)胞培養(yǎng)二：細(xì)胞培養(yǎng) w 1 離體的小鼠肝細(xì)胞和1.0mm-10mm醋氨酚培養(yǎng)2 h，觀察肝細(xì)胞損傷程度。2 另組加入不同劑量利福平和不同劑量醋氨酚培養(yǎng)2 h，觀查肝細(xì)胞損傷程度，觀察利福平是否有預(yù)防肝細(xì)胞損傷作用。 擬采用的研究方法、關(guān)鍵技擬采用的研究方法、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)及解決途徑術(shù)指標(biāo)及解決途徑w 3觀察利福平對(duì)已損傷的肝細(xì)胞損傷是否有恢復(fù)作用，將1.0mm醋氨酚培養(yǎng)

8、1.5 h沖洗移除非共價(jià)結(jié)合aa，重新懸浮在含利福平的培養(yǎng)基中，觀察。對(duì)照可選擇生理鹽水、nac（n-乙酰半胱氨酸，2.0mm）和dtt（二硫蘇糖醇，1.5mm），dtt能減少細(xì)胞毒性。w 有條件可以用napqi做細(xì)胞培養(yǎng)。擬采用的研究方法、關(guān)鍵技擬采用的研究方法、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)及解決途徑術(shù)指標(biāo)及解決途徑w 三：利福平對(duì)肝臟cyp2e1表達(dá)的作用的研究及對(duì)醋氨酚中毒引起的細(xì)胞dna損傷的作用的研究w cyp2e1是促使健康人形成napqi形成的主要酶，p450酶的其它異構(gòu)酶對(duì)此作用微小。課題的創(chuàng)新點(diǎn)課題的創(chuàng)新點(diǎn)w 在黃仁彬教授研究的基礎(chǔ)上，從分子水平進(jìn)一步深入闡明利福平對(duì)醋氨酚肝毒性的保護(hù)作用的機(jī)制。預(yù)期結(jié)果預(yù)期結(jié)果w 利福平可能是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的和napqi作用，從而達(dá)到提高gsh含量，減輕napqi對(duì)肝細(xì)胞的損傷。也有可能利福平對(duì)肝臟的某種酶有相關(guān)作用。 研究基礎(chǔ)w 本實(shí)驗(yàn)室多年從事生化藥理及毒理的研究