ELISA常見問題及處理方法4頁

1、ELISA常見問題及處理方法一、概述ELISA試驗以靈敏度較高,特異性較好的特點(diǎn)在臨床上、獸藥殘留檢測得到了廣泛的應(yīng)用,但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大,如不注意,有可能導(dǎo)致實驗失敗。二、樣本的處理步驟：采樣與樣品的制備（樣品預(yù)處理）提取凈化濃縮檢測三、樣品制備 （1）樣本采集來后應(yīng)應(yīng)注意：1.遵循代表性原則2.除去不可食部分3.防止處理樣本時被污染3.如需制成同一樣本，應(yīng)將其混勻后再分次勻?qū)?.勻?qū)⒑蠓执盅b(一般用2號自封袋,每袋約30g)5.樣品儲存在206.不使用有異味或壞了的樣本.四、藥物提取 用溶劑將待測樣品中獸藥溶解、分離出來的操作步驟。 根據(jù)樣本和待測獸藥種類，用不同

2、溶劑和方法進(jìn)行提取。¬ 原理：相似相溶。選擇與待測獸藥極性相似的溶劑，提取劑沸點(diǎn)應(yīng)4580，且不能與樣本發(fā)生作用，毒性低，價格便宜，必須能溶解待測獸藥。對含水量高的樣本，一般選與水相混溶的溶劑（乙腈、丙酮等），要求溶劑對樣本有較強(qiáng)的滲透能力，以便能將樣本中獸藥充分提取。當(dāng)單一溶劑效果不理想，可選擇2種或2種以上不同極性的溶劑，以不同比例配成混合提取劑。四、提取方法¬ 振蕩法：將提取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使容器內(nèi)的樣品與提取溶劑充分接觸，以深入到樣本組織內(nèi)部提取待測組分¬ 振蕩方式：¬ 振蕩器上進(jìn)行上下、往返式振蕩。手搖式上下振蕩¬

3、; 注： 1、在組織樣本中加入有機(jī)溶劑之間提取時，應(yīng)邊加邊振蕩，防止組織凝結(jié)成團(tuán)，不利于提取。均質(zhì)法：用均質(zhì)機(jī)對加提取劑的樣本快速均質(zhì)。特點(diǎn)是快速、簡便。超聲法：樣本加入提取劑，以超聲波提取。索氏提取：提取效果好，但時間長，干擾物多。多用于動物樣本?？焖倩靹蚍ǎ哼m用于液體樣品。五、凈化 將樣本中待測獸藥與干擾雜質(zhì)分離的步驟。原則是盡量完全除掉干擾雜質(zhì)，而又使待測獸藥損失盡量少。但經(jīng)過提取的待測組分，提取物中通常含有一些會干擾試劑盒中抗原抗體反應(yīng)的雜質(zhì)或者是含有與待測物結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)，這就導(dǎo)致我們在檢測過程中出現(xiàn)假陽性。在我們現(xiàn)有的試劑盒前處理方法中涉及到的最常見的凈化是：液液分配法（還可以用吸

4、附柱層析和固相萃?。?六、濃縮由于凈化過程中引入的溶劑，可能會降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去處全部有機(jī)溶劑進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換。相當(dāng)于試劑盒前處理步驟中把樣本在60度氮?dú)庀麓蹈?，再用?fù)溶液溶解干燥殘留物。一濃縮方式：氮?dú)獯蹈沙s 壓縮空氣吹干除雜注意： 1、在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，防止雜質(zhì)干擾。 2、在吹樣本積時，針頭應(yīng)在液面上空，避免與樣本接觸，防止產(chǎn)生交叉污染。 3、樣本吹干后應(yīng)立即取下，避免吹的時間過長，影響最終檢測結(jié)果。 4、不同的藥物，吹干后樣本的保質(zhì)期不同，提倡待樣本回到室溫后立即復(fù)溶。二、加 樣¬ 1.手工操作中,加樣板過多造成加樣后放 入孵箱前等待 時間

5、過長¬ 2.加完標(biāo)本再加酶試劑時酶濺出孔外¬ 3.加樣方式（吸二打一）¬ 4.加樣后及時放入孵箱三、孵 育¬ 1.孵育時未貼封片或加蓋,使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)¬ 2.孵育時間不夠,導(dǎo)致顯示弱3.孵育時間人為延長,導(dǎo)致非特異性結(jié)合¬ 4.孵育時保持溫度平衡四、洗 板¬ 1.采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉¬ 2.采用半自動洗板機(jī)洗板時,洗液量不足,導(dǎo)致洗板不徹底;洗板針堵塞,抽吸不完全;洗板不暢,導(dǎo)致洗板效果差.¬ 3.反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長¬ 4.洗板次數(shù)太多或太少五、顯 色1. 顯色劑配制后

6、放置時間過長或使用過期顯色劑;2. 加顯色劑時濺出孔外造成液體回流六、終 止.加終止液時產(chǎn)生較多氣泡,導(dǎo)致假陽性增加七、讀板¬ 1.讀板時板底不清潔.-注意不要將板放在漏有洗洗的地方或不清潔的地方。¬ 2.讀板時沒有樣本的地方也顯示出OD值-板底粘了蓋板膜或酶標(biāo)儀設(shè)置錯誤¬ 3.讀板時樣本顏色很深，打出的OD值很低-酶標(biāo)儀時間用長，光 強(qiáng)變?nèi)趸蚴敲笜?biāo)儀未自檢就直接開始打數(shù)據(jù) 無顏色¬ 1.試劑孵育的時間沒有按說明書操作¬ 2.不同試劑盒或不同批號的試劑混用¬ 3.漏加酶¬ 4. HRP酶污染了疊氮鈉¬ 5.標(biāo)準(zhǔn)品有

7、問題（標(biāo)準(zhǔn)品有問題）¬ 6.某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質(zhì)¬ 7.漏加顯色劑A或B¬ 8.試劑配制/使用有誤¬ 9.緩沖液污染高背景（本底）1.洗滌操作不規(guī)范2.實驗中孵育溫度和時間不適當(dāng)3.酶加量過多4.封閉不完全5.標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的干擾物質(zhì)6.顯色劑受光照時間較長,或污染7.整批樣品放置時間過長,樣品污染8.緩沖液污染9.吸頭重復(fù)使用,未洗凈或消毒不完全而用于加酶或顯色劑顯色弱¬ 1.超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號¬ 2.加入試劑的體積和時間有誤¬ 3.試劑、樣品用前未能平衡¬ 4.縮短孵育時間能使實驗的

8、信號變?nèi)?#172; 5.在溫度變化的環(huán)境內(nèi)孵育酶標(biāo)板¬ 6.使用了被污染的試劑¬ 7.標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本制備方法不規(guī)范¬ 8.樣本的陽性太高 ¬ 9.某些試劑盒需要稀釋才使用的試劑稀釋倍數(shù)錯誤 ¬ 10.不同批次的試劑盒混用 ¬ 11.點(diǎn)板時間過長 ¬ 12.洗板時間過長或過多 ¬ 13.儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配高CV值1.板條本身的因素2.操作不慎或洗滌不充分3.取樣時樣本未混勻，樣本中正己烷未取凈。標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)之間OD值區(qū)別很小1.酶結(jié)合物不足2.捕獲抗體沒有很好結(jié)合到板上3.操作不慎4.標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋度計算有誤

9、5.顯示時間不足(個別項目如氯霉素) 精密度：指用某種方法重復(fù)測定同一均質(zhì)樣品所得測定值的彼此接近程度，表示分析結(jié)果的重復(fù)性。常用標(biāo)準(zhǔn)差（SD）或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。 重復(fù)性：短期內(nèi)相同實驗條件下（實驗室、操作者、儀器型號和試劑批號），對同一樣品測定結(jié)果的精密度。¬ 重現(xiàn)性：指不同實驗條件下使用某種分析方法對同一樣品各個獨(dú)立測定值間的精密度。¬ （重現(xiàn)性>重復(fù)性） ¬ 精密度與待側(cè)物的濃度關(guān)系： ¬ 濃度（µg/kg） CV（%） 1 35 110 30 10100 20 100 15¬ 對于定量方法，在靈敏度范圍CV&

10、lt;15%,其它添加濃度CV<25%。 ¬ 準(zhǔn)確度：指測定值（平均值）與真實值的接近程度，表示分析結(jié)果的正確性。通常用添加回收率表示。¬ 回收率：在空白樣本中添加一定量待測獸藥標(biāo)準(zhǔn)樣品，制成已知含量的樣本，然后按擬定的方法對樣本進(jìn)行提取、凈化和測定。所得到的實測值與已知值比較，實測值與已知值的百分率即為方法添加回收率。添加回收率應(yīng)以接近100%為最佳。但是由于試樣中種類和獸藥品種多，以及雜質(zhì)干擾、操作誤差等原因。要求回收率為70120%，平均回收率80%即符合要求。 加標(biāo)量原則上應(yīng)以接近待測試樣中獸藥含量為宜，但由于待測樣本中獸藥殘留量未知，因此一般以該試樣的獸藥高

11、殘留限量作為參照，一般以規(guī)定的MRL值接近的濃度作為中檔添加濃度，低于和高于MRL值一個數(shù)量級的濃度作為低檔和高檔添加濃度。 檢測限（LOD limit of detection）：指分析方法能夠從樣品背景信號中檢測出待測物質(zhì)存在時所需最低濃度。LOD反映了分析方法整體的靈敏度效能指標(biāo)。一般對分析方法在LOD水平的定量可信性（如精密度、回收率）不作要求，一般要求殘留分析方法LOD0.1MRL 影響LOD的因素：檢測器靈敏度、試劑盒靈敏度、基質(zhì)干擾（凈化效果）、濃縮倍數(shù)，宜注重提高凈化效果，而不應(yīng)完全依據(jù)增加進(jìn)樣量或濃縮倍數(shù)來降低檢測限。 定量限¬ 定量限（LOQ limit of q

12、uantitation）：指分析方法能夠?qū)悠分写郎y物進(jìn)行定量測定的最低濃度。用于定量方法的驗證。¬ 一般要求其CV20%,回收率70%，方法LOQ0.2MRL 溶劑極性表¬ 基團(tuán)的極性排序（由小到大）： ¬ CH2 < CH=CH<OR<X<NO2<N（CH3）2<COOR< >C=O<LCHO<SH<NH2<NHCOR<OH<ArOH<COOH¬ 溶劑的極性由強(qiáng)到弱順序：水乙腈甲醇乙酸乙醇異丙醇丙酮正丁醇正戊醇乙酸乙酯二氯甲烷三氯甲烷苯甲苯二甲苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷正己烷（石油醚）常用溶劑參數(shù)溶劑分子式常壓