香蕉枯萎病菌快速檢測技術(shù)

1、    香蕉枯萎病菌快速檢測技術(shù)    陳帆香蕉枯萎病作為一種檢疫性病害，主要侵染帶菌的球莖、病株殘體及帶菌土壤，并隨病株殘體、帶菌土壤、農(nóng)耕工具等進行傳播，嚴(yán)重影響我市香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究運用雙重抑菌法，對采自漳州各地蕉園的香蕉組織和土壤樣本進行處理，以達(dá)到快速檢測香蕉枯萎病菌4號生理小種的目的。同時，通過鑒定菌落形態(tài)及its-scar檢驗確定標(biāo)的菌。1 檢測材料與方法1.1 采樣地點及樣本類型土壤樣本來自漳州市赤湖、天寶鎮(zhèn)后寨村、薌城區(qū)浦南鎮(zhèn)松洲村等地香蕉園。1.2 土壤懸浮液中選擇性抑菌劑的確定把采集的土壤樣本配制成土壤懸浮液，分別加入0.1 g

2、.l-172 %甲霜靈、50 %異菌脲、25 %咪鮮胺、40 %睛菌唑、25 %三唑酮和70 %惡霉靈作為土壤懸浮液中;同時分別加入0.1 g.l-1硫酸鏈霉素（streptomycin sulfate）作為細(xì)菌抑菌劑。以未添加殺菌劑的土壤懸浮液以為對照。將混有不同抑菌劑的土壤懸浮液涂布在km培養(yǎng)基上，7 d后觀察菌落生長情況。1.3 土壤懸浮液中抑菌劑最適濃度的選擇將1.2實驗中篩選出的抑菌劑f1，采用黃金分割法稀釋0.618倍、0.6182 倍、0.6183倍，配制成抑菌劑f2、抑菌劑f3、抑菌劑f4，將含有4種不同濃度抑菌劑的土壤懸浮液分別涂布在km培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)， 7 d后觀察菌落

3、生長情況（表1-1）。1.4 土壤懸浮液中抑菌劑作用時間的確定將混有最佳抑菌濃度的土壤懸浮液分別靜置10 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min，在km培養(yǎng)基上均勻涂布每一時間段的土壤懸浮液，觀察菌落生長情況和顏色特征。2 結(jié)果與分析2.1 土壤懸浮液中抑菌劑篩選試驗結(jié)果顯示：硫酸鏈霉素分別和咪鮮胺、三唑酮組成的抑菌劑a和抑菌劑b對標(biāo)的菌和非標(biāo)的菌均有很強的抑制作用（圖2-1，a-b）。硫酸鏈霉素分別和異菌脲、和睛菌唑、惡霉靈組成的抑菌劑c、抑菌劑d和抑菌劑e難以分離出標(biāo)的菌且仍有少量非標(biāo)的菌生長（圖2-1，c-e）。而硫

4、酸鏈霉素和甲霜靈組成的抑菌劑f在km培養(yǎng)基中分離出的菌落較為單一，生物學(xué)特征明顯（圖2-1，f）?？梢姡涸谕寥缿腋∫褐刑砑佑杉姿`和硫酸鏈霉素組成的抑菌劑f可有效分離出香蕉枯萎病菌4號生理小種且抑制了其他雜菌的干擾。2.2 土壤懸浮液中抑菌劑最適濃度的確定在km培養(yǎng)基上涂布含有不同濃度抑菌劑的土壤懸浮液，試驗結(jié)果顯示：抑菌劑f1和抑菌劑f2在培養(yǎng)8d后才長出較少的標(biāo)的菌，且性狀不明顯;抑菌劑f3能夠在3 d內(nèi)長出標(biāo)的菌，且數(shù)量適中，特征明顯。抑菌劑f4由于濃度偏低，標(biāo)的菌和非標(biāo)的菌均有生長（圖2-2）?？梢?，由甲霜靈0.053g.l-1，硫酸鏈霉素0.115g.l-1組成的抑菌劑f3為最適濃度

5、。2.3 土壤懸浮液中抑菌劑作用時間的確定在 km培養(yǎng)基上均勻涂布含有抑菌劑f3的土壤懸浮液，靜置10-40 min，由于時間較短，標(biāo)的菌落數(shù)較多、較小，形態(tài)特征不明顯，且尚有非標(biāo)的菌生長;靜置60 min，可促進標(biāo)的菌有效生長且性狀明顯，而且強烈抑制了非標(biāo)的菌生長。而靜置80min后菌落數(shù)開始減少，菌落形態(tài)特征不明顯。可見，由甲霜靈0.053g.l-1和硫酸鏈霉素0.115g.l-1組成的抑菌劑f3，對土壤懸浮液處理60 min可顯著提高km培養(yǎng)基對香蕉枯萎病菌4號小種的選擇性（圖2-3）。抑菌時間（min）2.4 km培養(yǎng)基雙重選擇檢測結(jié)果試驗結(jié)果顯示：將未含有抑菌劑f3的土壤懸浮液涂布在km培養(yǎng)基上能分離出香蕉枯萎病菌4號小種，但是菌落較小、特征不明顯，且仍有其他雜菌生長。而采用雙重選擇抑菌法，即在km培養(yǎng)基上均勻涂布含有抑菌劑f3的土壤懸浮液可檢測出單一的香蕉枯萎病菌4小號種（圖2-4）。a： km培養(yǎng)基單抑菌檢測;b： km培養(yǎng)基雙重抑菌檢測2.5 its-scar檢測運用雙重抑菌法分離出來的菌落，通過its-scar檢測確定為香蕉枯萎病菌4號生理小種（圖2-5）。3 討論由于前人研制的km培養(yǎng)基能夠較好分離出單一的香蕉枯萎病菌4號小種，但在實踐中仍易受其他雜菌干擾。為了提高培養(yǎng)基的專化性及