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1、Mouse Y-Linked Zfy1 and Zfy2 Are Expressed during the Male-Specific Interphase between Meiosis I and Meiosis II and Promote the 2nd Meiotic Division報告人：秦炳燕 組 員：王緒海 袁方圓2015.11.6背景實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果討論結(jié)論l鼠zfy1和zfy2基因是在研究鼠Y染色體上促進(jìn)雄性發(fā)育的基因時首先被確定的；它們編碼的蛋白質(zhì)通過一個“鋅指”結(jié)構(gòu)域，調(diào)控其他基因的表達(dá)，這些基因在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。l這兩個基因曾被預(yù)測在粗線期（zfy1和z

2、fy2）和減數(shù)第一次分裂中期（zfy2）可以促進(jìn)減數(shù)分裂。l然而，通過這些以往的研究，Y染色體上編碼基因的附加作用都是被推斷出來的。本研究的目的為了確定這些基因并且探究它們在減數(shù)分裂后期的功能。我們使用了三個XO雄性小鼠模型，其Yp基因含量是遞減的并且缺少Yq：lXSxraO：X攜帶Yp-derived性-反轉(zhuǎn)因子Tp(Y)1CtSxr-a， Tp(Y)1CtSxr-a可以提供幾乎完整的Yp基因lXSxrbO ：X攜帶一個Sxra 衍生物Tp(Y)1CtSxr-b， Tp(Y)1CtSxr-b有1.3Mb的缺失(DSxr-b)，移除 了大部分Yp基因。lXOSry：僅有Sry基因A. XY.

3、A. XY. XY雄性的Y短臂基因complement包含7個單拷貝基因，兩個重復(fù)基因（重疊基因）和一個多拷貝基因。擬染色體區(qū)域（PAR）位于Y長臂遠(yuǎn)側(cè)，在減數(shù)分裂產(chǎn)生XY性二價體的過程中介導(dǎo)配對和交換。B. XSxraO. B. XSxraO. Yp-derived Sxra 性反轉(zhuǎn)因子，附著在X PAR遠(yuǎn)端，提供幾乎完整的Yp基因C.XSxrbO.C.XSxrbO. Sxra-derived 缺失變體Sxrb有1.3Mb缺失( DSxr-b)移除6個單拷貝基因，跨越刪除斷點(diǎn)生成一個zfy2/1融合基因( )。D.XOSry. D.XOSry. 這個模型只有一個Y染色體基因，為睪丸決定因素S

4、ry，作為一個位于常染色體的轉(zhuǎn)基因。E.YE.Y* *E E 這個微型性染色體是X染色體從近端proximal到Amelx有一個缺失，+代表缺失位點(diǎn)。這個X染色體衍生物有一個完整的PAR，可以與XSxra ，XSxrb or X的PAR配對形成一個minimal性二價體。l后兩種Yp-缺陷型模型在精原細(xì)胞增殖中有顯著地抑制，我們通過添加Eif2s3y規(guī)避這種抑制。（Eif2s3y:精原干細(xì)胞擴(kuò)增因子）lX-染色體衍生物（用Y*X表示)規(guī)避MI 紡錘體組裝檢查點(diǎn)（MI SAC)/凋亡消除。Figure 2.Figure 2. SYCP3抗體（綠色）和CREST（紅色）染色6周齡XY和XEY*XS

5、ry睪丸的粗線期精母細(xì)胞擴(kuò)散。方框顯示XY和XEY*XSry雄鼠中 PAR-PAR性染色體聯(lián)會，箭頭指出了在一個XEY*XSry雄鼠中的一個未聯(lián)會的Y*X染色體。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果-YpYp- -編碼的遺傳信息促進(jìn)減數(shù)第二次編碼的遺傳信息促進(jìn)減數(shù)第二次分裂分裂1.1. XY*X雄鼠中XY聯(lián)會效率三個Y*X補(bǔ)充模型之間的PAR-PAR聯(lián)會并沒有顯著差異。剩余細(xì)胞要么X和Y*X PARs未配對，要么缺少一個可識別的Y*X。后一種情況可能是小Y*X染色體在細(xì)胞擴(kuò)散中丟失。A.單倍體圓形精子的百分比。Yp-derived Sxrb和Sxra在Y*X存在的請況下促進(jìn)減數(shù)第二次分裂。Sxra明顯比Sxrb更有

6、效。2）減數(shù)分裂效率用DAPI熒光強(qiáng)度測定對SYCP3標(biāo)記的睪丸細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)行DNA定量分析，收集數(shù)據(jù)。結(jié)論：結(jié)論：鼠鼠YpYp上存在上存在某些某些遺傳信息遺傳信息在在性二價體性二價體存在的情況下存在的情況下促進(jìn)減數(shù)第促進(jìn)減數(shù)第二次分裂二次分裂兩個XO模型并沒有顯示Sxrb促進(jìn)減數(shù)第二次分裂；減數(shù)第二次分裂并不是通過性二價體本身的形成來促進(jìn)的，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果- Zfy1和/或Zfy2促進(jìn)第二次減數(shù)分裂 Sxrb的蛋白編碼基因含量僅限于幾個Rbmy副本，H2al2y，Sry和zfy2/1融合基因的兩個拷貝。在正常的睪丸中，間期次級精母細(xì)胞是一種非常短暫的細(xì)胞類型，沒有公布的信息說這些基因在這一時期

7、有所表達(dá)。通過RNA原位分析顯示Rbmy、 H2al2y不太可能在間期次級精母細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。而Sry 轉(zhuǎn)錄存在于成年鼠睪丸中。因此，我們最初的焦點(diǎn)是zfy2/1融合基因，它被認(rèn)為是在早前期轉(zhuǎn)錄的，是在粗線期開始時通過減數(shù)分裂性染色體失活而被沉默的。Sxrb缺失斷點(diǎn)是位于zfy1和zfy2的5內(nèi)含子之間的序列同源性的95bp范圍內(nèi)，并且融合基因編碼的蛋白質(zhì)被預(yù)測是與zfy1編碼的蛋白質(zhì)幾乎一模一樣（除了第16個氨基酸亮氨酸代替了苯丙氨酸）。B.單倍體圓形精子百分比1.zfy1促進(jìn)第二次減數(shù)分裂2.zfy2轉(zhuǎn)基因比zfy1轉(zhuǎn)基因更能有效促進(jìn)減數(shù)第二次分裂。3.zfy1和zfy2的組合對促進(jìn)減數(shù)第二次

8、分裂非常有效實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果- Zfy1和/或Zfy2促進(jìn)第二次減數(shù)分裂 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果-Zfx,zfy1和zfy2在減數(shù)第二次分裂前的間期轉(zhuǎn)錄為了檢測zfy1和zfy2在間期次級精母細(xì)胞中的表達(dá)，我們用zfy1和zfy2RNA-FISH（熒光原位雜交）檢測DAPI- and SYCP3-染色的XY雄鼠睪丸細(xì)胞的擴(kuò)散，用zfy1和zfy2DNA-FISH（熒光原位雜交）確定Y染色體的存在。鼠zfy和zfx基因在間期次級精母細(xì)胞中表達(dá)。間期次級精母細(xì)胞核與RNA FISH 探針雜交，通過用SYCP3 抗體(red, top panels)染色生精細(xì)胞將間期次級精母細(xì)胞從二倍體精子中分離出來。RNA

9、 FISH探針到編碼基因的合適的定位是通過DNA FISH 確定。細(xì)胞核用DAPI染色（藍(lán)色）。檢測到Y(jié)-bearing 次級精母細(xì)胞的zfy1和zfy2的轉(zhuǎn)錄分別為45%和27%，在一半的次級精母細(xì)胞（X-bearing）中并沒有觀察到zfy1和zfy2 DNA-FISH信號并且它們也缺乏zfy1和zfy2RNA-FISH信號。然而，92%的這些X-bearing次級精母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄為與之相關(guān)的X-linked 基因zfx將這個轉(zhuǎn)基因添加到XEY*XSry ，單倍體精子比例從15.0%增加到79.9%，表明zfx可以促進(jìn)減數(shù)第二次分裂。粗線期（Pa）二倍體精子細(xì)胞（Std）單倍體精子細(xì)胞（Sth

10、)體外分析比較zfx，zfy1,zfy2 和常染色體zfa的反式激活結(jié)構(gòu)域， zfy2比zfy1具有更強(qiáng)有效的酸性結(jié)構(gòu)域。Zfx比zfy1的更弱。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果- zfy2比zfy1的反式激活結(jié)構(gòu)域更強(qiáng)- 半乳糖水平是Gal4-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的。我們以前關(guān)于三個具有不同的補(bǔ)體的XO雄性模型減數(shù)分裂的研究顯示，在Yp基因缺乏的模型XEOSry和XESxrb中，大部分的精母細(xì)胞在減數(shù)第二次分裂之前達(dá)到分裂間期；然而，它們未能使染色體重新聚集來完成減數(shù)第二次分裂而是形成二倍體圓形精子A.XO模型。在XEOSry和XESxrb雄鼠中，大部分的精母細(xì)胞完成減數(shù)第一次分裂，這是因?yàn)橛捎趜fy2的缺失

11、導(dǎo)致在MI凋亡反應(yīng)的減少。Zfx表達(dá)可能是凋亡反應(yīng)殘留的原因，大部分的精母細(xì)胞被滯留在減數(shù)第一次分裂和減數(shù)第二次分裂的間期。這可能是MI SAC通過單價X 前期觸發(fā)的結(jié)果，凋亡反應(yīng)的減少凋亡反應(yīng)的減少是由于是由于zfy2 zfy2 的缺失，或者的缺失，或者YpYp基因或促進(jìn)減數(shù)第二次分裂的基因的缺失。基因或促進(jìn)減數(shù)第二次分裂的基因的缺失。在XSxraO雄性中，有一個非常有效的MI期精母細(xì)胞的凋亡消除以便只有極少數(shù)完成減數(shù)第一次分裂并且這導(dǎo)致精子細(xì)胞的數(shù)量減少了97%。這排除了關(guān)于Yp基因完成減數(shù)第二次分裂的作用的任何確定的結(jié)論，因?yàn)榈蛲鱿赡芷蛴谝瞥齅I細(xì)胞，that這些細(xì)胞不然也注定會在

12、下一個間期被滯留/抑制。B. XY*X模型。在這個模型中，形成一個性二價體的精母細(xì)胞避免了MI SAC /凋亡反應(yīng)并且完成減數(shù)第一次分裂。這表明，Sxra強(qiáng)有力的促進(jìn)了減數(shù)第二次分裂，因此可以確認(rèn)，一個基因或者Yp上的基因促進(jìn)了減數(shù)第二次分裂，凋亡反應(yīng)的規(guī)避是通過X-Y*X性二價體的形成來完成的。證實(shí)了證實(shí)了SxraSxra和和SxrbSxrb中存在促進(jìn)減數(shù)第二次分裂的遺傳信息，中存在促進(jìn)減數(shù)第二次分裂的遺傳信息，SxraSxra更有效。更有效。C. XY*XSryZf轉(zhuǎn)基因添加模型。這些轉(zhuǎn)基因表明zfy1和zfy2是Yp上促進(jìn)減數(shù)第二次分裂的基因，zfy2更有效。Sxrb包括編碼ZFY1-l

13、ike 蛋白的zfy2/1融合基因，而Sxra包括zfy1和zfy2,因此，可以解釋Sxra在促進(jìn)減數(shù)第二次分裂上更加有效。Zfx的過表達(dá)也促進(jìn)了減數(shù)第二次分裂（Figure5），說明內(nèi)源性zfx也在一定程度上促進(jìn)減數(shù)第二次分裂。lSxra和Sxrb之間效能的不同在于Sxra中存在zfy1和zfy2 ，然而Sxrb只有zfy2/zfy1融合基因，編碼與zfy1幾乎相同的蛋白質(zhì)。然而，在缺失Y*X 的情況下 Sxrb并沒有促進(jìn)減數(shù)第二次分裂，這意味著MI SACMI SAC的啟動的啟動and/orand/or凋亡反應(yīng)的減少，凋亡反應(yīng)的減少，阻礙了阻礙了減數(shù)第二次分裂進(jìn)減數(shù)第二次分裂進(jìn)行行。l在X

14、O雌性中有MISAC反應(yīng)，但是沒有凋亡反應(yīng)。XO卵母細(xì)胞可以完成減數(shù)第一次分裂以產(chǎn)生MII卵母細(xì)胞，要么具有XX性染色體，要么缺少X染色體，但均能在不啟動MIISAC 反應(yīng)情況下完成減數(shù)第二次分裂。這表明，三個XO雄性模型中，MI SAC 自身啟動并不會抑制減數(shù)第二次分裂。l作為凋亡反應(yīng)減少的結(jié)果，在MI期，MI DNA損傷的減少對于觸發(fā) 消除是不夠的，但是足以在減數(shù)第一次分裂間期后觸發(fā)G2/M DNA 損傷檢查點(diǎn)并且阻止進(jìn)入MII。這些被阻止的間期細(xì)胞隨后作為二倍體精子進(jìn)入精子形成。Figure8 。MI SAC與G2/MII checkpoint結(jié)合模型，A.在XSxraO 模型中，每個M

15、I精母細(xì)胞將有一個單價X，可以觸發(fā)MI SAC并且引起MI進(jìn)程中一個短暫的延遲。為了解釋這些來自很少幸存的MI精母細(xì)胞的單倍體和二倍體精子細(xì)胞的混合，我們提出：1）這些稀少的MI精母細(xì)胞伴隨著凋亡DNA損傷完成減數(shù)第一次分裂，凋亡DNA損傷可以在隨后的間期觸發(fā)G2/MII檢查點(diǎn)并且封鎖MII進(jìn)程-這些間期次級精母細(xì)胞然后形成二倍體精子細(xì)胞。2)在極少數(shù)情況下，MI精母細(xì)胞通過實(shí)現(xiàn)兩極附著逃避MISAC和凋亡-這些完成減數(shù)第一次分裂和減數(shù)第二次分裂的細(xì)胞形成單倍體精子。B. 在XY*XSxra模型和XY模型中，盡管兩個單價染色體完成兩極附著的可能性非常低,但也遵循上面的路徑1）和2），已經(jīng)形成性

16、二價體的MI細(xì)胞將會通過這兩部進(jìn)一步形成單倍體精子。zfy2和zfy1均促進(jìn)減數(shù)第二次分裂，但在MI只有zfy2促進(jìn)單價X染色體精母細(xì)胞的強(qiáng)凋亡消除。減數(shù)第一次分裂和減數(shù)第二次分裂之間的短時間減數(shù)第一次分裂和減數(shù)第二次分裂之間的短時間間隔間隔Zfy1Zfy1功能的復(fù)活基礎(chǔ)是什么？功能的復(fù)活基礎(chǔ)是什么？l通過之前的研究得出，zfy1和zfy2在偶線期轉(zhuǎn)錄，但隨著MSCI轉(zhuǎn)錄終止，因此，MI期，zfy2可能是通過從偶線期轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)錄的ZFY2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化發(fā)揮作用的。l為什么凋亡作用局限在zfy2?在轉(zhuǎn)錄的粗線期階段Zfy轉(zhuǎn)錄體的選擇性剪接導(dǎo)致81%的zfy1轉(zhuǎn)錄體缺失外顯子6使得編碼的蛋白質(zhì)缺乏反

17、式激活作用活性，然而，96%的zfy2轉(zhuǎn)錄體有外顯子6，因此具有TA結(jié)構(gòu)域功能。l我們目前TA結(jié)構(gòu)域分析進(jìn)一步表明少數(shù)完整的Zfy1轉(zhuǎn)錄體是在偶線期產(chǎn)生的，進(jìn)而生成的蛋白質(zhì)攜帶的TA結(jié)構(gòu)域與zfy2的相比不再那么強(qiáng)大。鑒于這一點(diǎn)，我們認(rèn)為減數(shù)第二次分裂中我們認(rèn)為減數(shù)第二次分裂中zfy1zfy1的功能是以間期次的功能是以間期次級精母細(xì)胞的重新轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的級精母細(xì)胞的重新轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的（并且這也適用于zfy2）。這也意味著這個時期帶有編碼TA結(jié)構(gòu)域的外顯子6的zfy1具有更強(qiáng)大的表達(dá)。lzfx有助于MI（間接地）和減數(shù)第二次分裂（可能直接的）Zf介導(dǎo)的功能，因?yàn)槲覀兊臄?shù)據(jù)顯示zfx轉(zhuǎn)基因顯著促進(jìn)了減數(shù)第二次分裂和MI單價X染色體的凋亡反應(yīng)。l之前我們發(fā)現(xiàn)，在間期次級精母細(xì)胞中有鼠Y基因