第3章__蛋白質(zhì)的通性、純化和表征

1、第第3 3章章 蛋白質(zhì)的通性、純化和表征蛋白質(zhì)的通性、純化和表征本節(jié)學(xué)習(xí)重點(diǎn)與目標(biāo)本節(jié)學(xué)習(xí)重點(diǎn)與目標(biāo)l掌握蛋白質(zhì)的兩性及膠體性質(zhì)l掌握蛋白質(zhì)分離和純化的原理及方法；l掌握蛋白質(zhì)相對(duì)分子量及含量、純度的測(cè)定重點(diǎn)重點(diǎn)難點(diǎn)難點(diǎn)一、一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。 等電點(diǎn)：對(duì)某一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，在某一等電點(diǎn)：對(duì)某一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，在某一pHpH，它所帶的正，它所帶的正電荷和負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一電荷和負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pHpH稱(chēng)為蛋稱(chēng)為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。白質(zhì)的等

2、電點(diǎn)。在等電點(diǎn)在等電點(diǎn)時(shí)時(shí)，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中不移動(dòng)，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中不移動(dòng),溶解度最小，粘度溶解度最小，粘度最大?？梢杂萌芙舛确ā⒕劢闺娪痉ǖ葴y(cè)定等電點(diǎn)。最大?？梢杂萌芙舛确?、聚焦電泳法等測(cè)定等電點(diǎn)。二、二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)分子直徑在蛋白質(zhì)分子直徑在1-1001-100nmnm之間，在水溶液中具有之間，在水溶液中具有膠體溶液膠體溶液的通性。的通性。1 1、穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素：穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素：蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)形成的蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)形成的水化層水化層將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔開(kāi)，不會(huì)互相碰撞凝聚而沉淀；開(kāi)，不會(huì)

3、互相碰撞凝聚而沉淀；兩性電解質(zhì)非等電狀態(tài)時(shí)，帶同種電荷，互相排斥不致聚兩性電解質(zhì)非等電狀態(tài)時(shí)，帶同種電荷，互相排斥不致聚集沉淀。集沉淀。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜半透膜，因此可以應(yīng)，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。一旦電荷被中和或水化層被破壞，蛋白質(zhì)顆粒聚集，便從一旦電荷被中和或水化層被破壞，蛋白質(zhì)顆粒聚集，便從溶液中析出沉淀。溶液中析出沉淀。2、沉淀蛋白質(zhì)的方法沉淀蛋白質(zhì)的方法鹽析法鹽析法:大量的中性鹽（大量的中性鹽（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl），），使蛋白質(zhì)使蛋白質(zhì)脫去脫去水化層水化層而聚集

4、沉淀；不引起變性。而聚集沉淀；不引起變性。有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑沉淀法：破壞水化膜，降低介電常數(shù)，丙酮、乙醇等；破壞水化膜，降低介電常數(shù)，丙酮、乙醇等；重金屬鹽沉淀法：重金屬鹽沉淀法：pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，與重金屬離子（時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，與重金屬離子（Hg2+.Pb2+.Cu2+等）結(jié)成不溶性沉淀；等）結(jié)成不溶性沉淀；生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀法：生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀法：pH小于小于pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類(lèi)的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：?jiǎn)螌幩?、苦味酸、堿試劑和酸類(lèi)的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：?jiǎn)螌幩?、苦味酸、鎢酸。

5、酸類(lèi)：三氯乙酸、磺基水楊酸；鎢酸。酸類(lèi)：三氯乙酸、磺基水楊酸；加熱變性沉淀法。加熱變性沉淀法。三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則純化的實(shí)質(zhì)：增加制品的純度或比活力純化的實(shí)質(zhì)：增加制品的純度或比活力一般程序：前處理、粗分級(jí)分離、細(xì)分級(jí)分離、結(jié)晶。一般程序：前處理、粗分級(jí)分離、細(xì)分級(jí)分離、結(jié)晶。電泳電泳 前前處處理理粗粗分分離離細(xì)細(xì)分分離離生物組織生物組織 無(wú)細(xì)胞提取液無(wú)細(xì)胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速離心解、差速離心選擇性沉淀法選擇性沉淀法親和親和層析層析離子交離子交換層析換層析精制后的蛋白質(zhì)精制后的蛋白質(zhì)凝膠凝膠過(guò)濾過(guò)濾疏水疏水層析層析吸附吸附層析層析1、前處理（、前

6、處理（pretreatment）：）：將組織和細(xì)胞破碎將組織和細(xì)胞破碎動(dòng)物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)動(dòng)物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)、勻漿器、超聲波處理；勻漿器、超聲波處理；植物組織和細(xì)胞：石英砂植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液研磨或用纖維素酶處理；提取液研磨或用纖維素酶處理；細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）如果所要蛋白質(zhì)集中在某一細(xì)胞組分，用差速離心法收集細(xì)胞的某一組如果所要蛋白質(zhì)集中在某一細(xì)胞組分，用差速離心法收集細(xì)胞的某一組分；分；如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。如果提取膜蛋白：

7、超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。2、粗分級(jí)分離（、粗分級(jí)分離（roughfractionation)一般用選擇性沉淀法。一般用選擇性沉淀法。（NH4）2SO4分級(jí)沉淀法（鹽析）分級(jí)沉淀法（鹽析）等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法3、細(xì)分級(jí)分離（、細(xì)分級(jí)分離（finefractionation)層析法：凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、吸附層析、親層析法：凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相和層析、疏水層析（反相HPLC）電泳法：凝膠電泳、等電聚焦、雙向電泳等電泳法：凝膠電泳、等電聚焦、雙向電泳等4、結(jié)晶（晶體保存）、結(jié)晶（晶體保存）結(jié)

8、晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過(guò)飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、結(jié)晶方法：使溶液略處于過(guò)飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH。四、四、蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小的差異（一）根據(jù)分子大小的差異透析法：將樣品裝透析法：將樣品裝在透析袋里，半在透析袋里，半透膜阻留透膜阻留prpr分子，分子，以達(dá)到除去蛋白以

9、達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸（鹽、低分子酸等）。等）。透析和超過(guò)濾法：都是利用蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透透析和超過(guò)濾法：都是利用蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)除去樣品中的小分子非蛋白物質(zhì)。膜的性質(zhì)除去樣品中的小分子非蛋白物質(zhì)。透析法：透析法：透析透析(dialysis) 利用透析袋把大利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方子化合物分開(kāi)的方法。法。透析進(jìn)行透析進(jìn)行透析完成透析完成超過(guò)濾法：施以一定的壓力超過(guò)濾法：施以一定的壓力強(qiáng)迫小分子物質(zhì)通過(guò)半透強(qiáng)迫小分子物質(zhì)通過(guò)半透膜，而按半透膜的篩孔大膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子。小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子

10、。 凝膠色譜法凝膠色譜法分子篩色譜。凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大分子分子篩色譜。凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大分子最先流出層析柱。最先流出層析柱。Sephadexstructure(Left:molecule;Right:model)凝膠過(guò)濾的過(guò)程凝膠過(guò)濾的過(guò)程（二）根據(jù)溶解度差異的分離法（二）根據(jù)溶解度差異的分離法蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析鹽溶：是指在適當(dāng)濃度的鹽溶：是指在適當(dāng)濃度的中性鹽溶液中，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)提高的現(xiàn)象，中性鹽溶液中，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)提高的現(xiàn)象，稱(chēng)鹽溶。稱(chēng)鹽溶。鹽析：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽（鹽析：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽（高鹽濃度）時(shí)，會(huì)破壞蛋白高鹽

11、濃度）時(shí)，會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層（即破壞了蛋白質(zhì)在水溶液的穩(wěn)定性因素）導(dǎo)質(zhì)分子表面的水化層（即破壞了蛋白質(zhì)在水溶液的穩(wěn)定性因素）導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度降低發(fā)生沉淀析出，稱(chēng)鹽析。致蛋白質(zhì)的溶解度降低發(fā)生沉淀析出，稱(chēng)鹽析。常用的飽和硫酸銨沉淀法分離純化蛋白質(zhì)就是利用鹽析的原理，不同常用的飽和硫酸銨沉淀法分離純化蛋白質(zhì)就是利用鹽析的原理，不同的蛋白質(zhì)對(duì)飽和硫酸銨的要求不同，所以，可以通過(guò)飽和硫酸銨的的蛋白質(zhì)對(duì)飽和硫酸銨的要求不同，所以，可以通過(guò)飽和硫酸銨的分級(jí)沉淀法分離各種蛋白質(zhì)。分級(jí)沉淀法分離各種蛋白質(zhì)。（三）（三） 根據(jù)電荷性質(zhì)的差異根據(jù)電荷性質(zhì)的差異1、電泳法、電泳法電泳：在電場(chǎng)的作用下，帶

12、電荷的蛋白質(zhì)或核酸分子將向與其電荷電泳：在電場(chǎng)的作用下，帶電荷的蛋白質(zhì)或核酸分子將向與其電荷符號(hào)相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱(chēng)為電泳。符號(hào)相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱(chēng)為電泳。意義：用于蛋白質(zhì)的分離、純化鑒定和分子量的測(cè)定。意義：用于蛋白質(zhì)的分離、純化鑒定和分子量的測(cè)定。2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳基本原理基本原理：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，根據(jù)被分離物質(zhì)在以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，根據(jù)被分離物質(zhì)在電場(chǎng)的作用下產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度而分離的方電場(chǎng)的作用下產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度而分離的方法。法。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠由單體由單體丙烯酰胺丙烯酰胺和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑甲甲叉雙丙烯酰胺叉雙丙烯酰

13、胺在催化劑的作用下聚合而成。網(wǎng)在催化劑的作用下聚合而成。網(wǎng)狀的大小決定于丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的狀的大小決定于丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度及兩者的比例。濃度及兩者的比例。SDS(sodium dodecyl sulfate)l若在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入若在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS，SDS是一種陰離子表面活性是一種陰離子表面活性劑，劑，幾乎能破壞蛋白質(zhì)中所有的非共價(jià)鍵，從而使多亞基蛋白質(zhì)解幾乎能破壞蛋白質(zhì)中所有的非共價(jià)鍵，從而使多亞基蛋白質(zhì)解聚，并使多肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，消除了蛋白質(zhì)形狀對(duì)遷移率的影響；聚，并使多肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，消除了蛋白質(zhì)形狀對(duì)遷移率的影響；lSDS帶有很多負(fù)電荷，與蛋

14、白質(zhì)結(jié)合以后，使變性蛋白質(zhì)帶上大量帶有很多負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合以后，使變性蛋白質(zhì)帶上大量的凈負(fù)電荷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，蛋白質(zhì)分子原的凈負(fù)電荷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，蛋白質(zhì)分子原有的電荷就變得無(wú)足輕重了，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷有的電荷就變得無(wú)足輕重了，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，所以在同一電泳條件下，分子量成為決定蛋白質(zhì)移動(dòng)速度的差別，所以在同一電泳條件下，分子量成為決定蛋白質(zhì)移動(dòng)速度的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳動(dòng)越慢。唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳動(dòng)越慢。lSDS可將蛋白質(zhì)解離成亞基，所以測(cè)出的分子量是亞基的分子量可將蛋白質(zhì)解

15、離成亞基，所以測(cè)出的分子量是亞基的分子量。3、等電聚焦、等電聚焦（1）基本原理）基本原理根據(jù)蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)進(jìn)行分離。利用這種技術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物根據(jù)蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)進(jìn)行分離。利用這種技術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物是在具有是在具有pH梯度的介質(zhì)中進(jìn)行，在外加電場(chǎng)作用下，各種蛋白質(zhì)梯度的介質(zhì)中進(jìn)行，在外加電場(chǎng)作用下，各種蛋白質(zhì)將移向并聚集（停留）在等于其等電點(diǎn)的將移向并聚集（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH梯度處，并形成一個(gè)梯度處，并形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。很窄的區(qū)帶。（2）優(yōu)點(diǎn)及主要用途）優(yōu)點(diǎn)及主要用途加樣位置和體積不受?chē)?yán)格限制，分辨率很高，可測(cè)定加樣位置和體積不受?chē)?yán)格限制，分辨率很高，可測(cè)定pI，分離速度快

16、，分離速度快，分離的蛋白質(zhì)不變性。分離的蛋白質(zhì)不變性。可用于蛋白質(zhì)和兩性分子的分離分析和蛋白質(zhì)可用于蛋白質(zhì)和兩性分子的分離分析和蛋白質(zhì)pI的測(cè)定。的測(cè)定。（3）基本操作）基本操作1、膠的制備、膠的制備(需兩性電解質(zhì)）需兩性電解質(zhì)）2、加樣和電泳、加樣和電泳3、染色和脫色、染色和脫色4、離子交換層析法、離子交換層析法 層析柱層析柱記記 錄錄 儀儀 低溫層析柜低溫層析柜（1 1）基本原理）基本原理 利用被分離物質(zhì)的電荷與層析載利用被分離物質(zhì)的電荷與層析載體電荷的相互作用達(dá)到分離純化。體電荷的相互作用達(dá)到分離純化。基質(zhì)：纖維素、交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、基質(zhì)：纖維素、交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、層析載體由

17、基質(zhì)和帶電基團(tuán)組成層析載體由基質(zhì)和帶電基團(tuán)組成層析載體的種類(lèi)：層析載體的種類(lèi)：陽(yáng)離子交換劑（帶負(fù)電）陽(yáng)離子交換劑（帶負(fù)電）如：磺丙基（強(qiáng)酸型）如：磺丙基（強(qiáng)酸型）SP-Sephadex-O-(CH2)3-SO3H陰離子交換劑（帶正電）陰離子交換劑（帶正電）如：二乙基氨基乙基（中強(qiáng)堿型）如：二乙基氨基乙基（中強(qiáng)堿型）纖維素離子交換劑纖維素離子交換劑交聯(lián)葡聚糖離子交換劑交聯(lián)葡聚糖離子交換劑鹽濃度的微小變化就會(huì)直接影響它對(duì)蛋白質(zhì)電荷吸附容鹽濃度的微小變化就會(huì)直接影響它對(duì)蛋白質(zhì)電荷吸附容量。量。因此，蛋白質(zhì)混合物的分離可以由改變?nèi)芤褐械柠}離子因此，蛋白質(zhì)混合物的分離可以由改變?nèi)芤褐械柠}離子強(qiáng)度和強(qiáng)度和

18、pH來(lái)完成。來(lái)完成。 蛋白質(zhì)與離子交換劑間的主要作用：靜電引力蛋白質(zhì)與離子交換劑間的主要作用：靜電引力（2 2）基本操作）基本操作1 1、樣品準(zhǔn)備、樣品準(zhǔn)備2 2、離子交換劑和層析柱的制備、離子交換劑和層析柱的制備選擇合適的離子交換劑，進(jìn)行預(yù)處理，柱床體積為樣品體積選擇合適的離子交換劑，進(jìn)行預(yù)處理，柱床體積為樣品體積的的2-52-5倍。倍。3 3、上樣。、上樣。4 4、目的蛋白的洗脫、目的蛋白的洗脫洗脫方式有逐步提高洗脫液的鹽濃度（離子強(qiáng)度）和逐步提洗脫方式有逐步提高洗脫液的鹽濃度（離子強(qiáng)度）和逐步提高洗脫液的高洗脫液的pHpH。5 5、洗脫液的鑒定和回收、洗脫液的鑒定和回收蛋白質(zhì)成分常用蛋白

19、質(zhì)成分常用280nm280nm紫外吸收法監(jiān)測(cè)紫外吸收法監(jiān)測(cè)（四）（四）親和層析親和層析親和層析：利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的親和層析：利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力，建立起來(lái)的一種有效的純化方法。識(shí)別能力，建立起來(lái)的一種有效的純化方法。配基：酶的底物、輔酶、抑制劑、效應(yīng)物及其結(jié)配基：酶的底物、輔酶、抑制劑、效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，激素與受體蛋白，抗原與抗體等。構(gòu)類(lèi)似物，激素與受體蛋白，抗原與抗體等。親和層析的原理：親和層析的原理：親和層析的原理親和層析的原理（五）高效液相層析（五）高效液相層析(HPLC) HPLC純化蛋白質(zhì)的報(bào)告大多局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)純化蛋白質(zhì)的報(bào)告大多局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)

20、模模(數(shù)毫克到數(shù)十毫克數(shù)毫克到數(shù)十毫克) Waters公司的公司的HPLC已備有大規(guī)模制備的層析柱。已備有大規(guī)模制備的層析柱。 將親和層析的高分辨力和將親和層析的高分辨力和HPLC的快速結(jié)合的快速結(jié)合 高效液相層析法的基本概念和分離理論與經(jīng)典的液高效液相層析法的基本概念和分離理論與經(jīng)典的液相色譜法及氣相色譜法一致。相色譜法及氣相色譜法一致。 高效液相層析儀高效液相層析儀 典型的高效液相層析儀包括輸液系統(tǒng)、層析柱與檢典型的高效液相層析儀包括輸液系統(tǒng)、層析柱與檢測(cè)系統(tǒng)三部分。流動(dòng)相用高壓泵輸入。測(cè)系統(tǒng)三部分。流動(dòng)相用高壓泵輸入。一般用微量注射器直接進(jìn)樣，也可采用六通一般用微量注射器直接進(jìn)樣，也可采

21、用六通閥門(mén)進(jìn)樣。閥門(mén)進(jìn)樣。HPLCHPLC中所用的檢測(cè)器最多應(yīng)用的是紫中所用的檢測(cè)器最多應(yīng)用的是紫外吸收檢測(cè)外吸收檢測(cè)(UV)(UV)，靈敏度可達(dá)，靈敏度可達(dá)ngng水平。此外，還水平。此外，還有熒光檢測(cè)器、示差析光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器有熒光檢測(cè)器、示差析光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等。等。 高效液相層析儀的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖高效液相層析儀的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖五、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定五、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定（一）（一）凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量凝膠過(guò)濾所用介質(zhì)為凝膠珠或稱(chēng)為凝膠顆粒，其內(nèi)部為凝膠過(guò)濾所用介質(zhì)為凝膠珠或稱(chēng)為凝膠顆粒，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠顆粒中具有大量微孔，

22、這些微孔只允許較小的分子凝膠顆粒中具有大量微孔，這些微孔只允許較小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而大于膠粒微孔的分子則被排阻在外進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而大于膠粒微孔的分子則被排阻在外洗脫時(shí)大分子隨洗脫液先流下來(lái)，洗脫液體積小；小分洗脫時(shí)大分子隨洗脫液先流下來(lái)，洗脫液體積??；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來(lái)穿去，歷程長(zhǎng)，后洗脫下來(lái)，洗子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來(lái)穿去，歷程長(zhǎng)，后洗脫下來(lái)，洗脫體積大脫體積大測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一般用交聯(lián)葡聚糖作為凝膠，商品名：測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一般用交聯(lián)葡聚糖作為凝膠，商品名：Sephadex測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（

23、logM）對(duì)）對(duì)Ve作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線再測(cè)出未知樣品洗脫體積再測(cè)出未知樣品洗脫體積Ve從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量（二）（二）SDSPAGE（十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）聚丙烯酰胺凝膠電泳）用用SDS和巰基乙醇（能打開(kāi)二硫鍵）處理和巰基乙醇（能打開(kāi)二硫鍵）處理蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)合物復(fù)合物用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值對(duì)它們的相對(duì)遷用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值對(duì)它們的相對(duì)遷移率作圖。同一電泳條件下，分子小，受阻小

24、，游動(dòng)快，遷移率作圖。同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動(dòng)快，遷移率大。相對(duì)分子質(zhì)量大者，遷移率小。移率大。相對(duì)分子質(zhì)量大者，遷移率小。測(cè)出待測(cè)樣品的相對(duì)遷移率測(cè)出待測(cè)樣品的相對(duì)遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量?jī)?yōu)點(diǎn)：快速，樣品用量少。優(yōu)點(diǎn)：快速，樣品用量少。缺點(diǎn)：誤差大，約為缺點(diǎn)：誤差大，約為10（誤差主要來(lái)源于（誤差主要來(lái)源于遷移距離的測(cè)量誤差）遷移距離的測(cè)量誤差）此方法只能測(cè)得單體蛋白質(zhì)、寡聚蛋白質(zhì)的亞此方法只能測(cè)得單體蛋白質(zhì)、寡聚蛋白質(zhì)的亞基的相對(duì)分子質(zhì)量基的相對(duì)分子質(zhì)量（三）沉降速度法測(cè)定相對(duì)分子量（三）沉降速度法測(cè)定相對(duì)分子量離心分離離心分離

25、r/min1800025000r/min4000080000r/minl沉降速度：沉降速度： 在離心時(shí)，沉降分子在單位時(shí)間在離心時(shí)，沉降分子在單位時(shí)間t t（以秒計(jì)）內(nèi)下沉（以秒計(jì)）內(nèi)下沉的距離的距離x x（以（以cmcm計(jì)）。以計(jì)）。以v v表示。表示。 v= dx/dtv= dx/dtl沉降系數(shù)沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient) ： 單位離心場(chǎng)沉降分子的沉降速度。單位離心場(chǎng)沉降分子的沉降速度。 dx/dt s= v /= v /2 2x x = 2v：沉降速度（：沉降速度（dx/dt）可以從實(shí)驗(yàn)測(cè)得。）可以從實(shí)驗(yàn)測(cè)得。：離心機(jī)轉(zhuǎn)子每秒鐘的角速度，以弧度：離心機(jī)轉(zhuǎn)子

26、每秒鐘的角速度，以弧度/秒計(jì)。秒計(jì)。x：從軸心到沉降界面的徑向距離（以：從軸心到沉降界面的徑向距離（以cm計(jì)）。計(jì)）。l蛋白質(zhì)、核酸、核糖體和病毒的沉降系數(shù)介于110-13 到20010-13 秒的范圍。l取10-13 秒作為一個(gè)單位，稱(chēng)為沉降系數(shù)沉降系數(shù)單位，即S。 例：例：牛血清清蛋白的沉降常數(shù)為牛血清清蛋白的沉降常數(shù)為:4.410-13用用沉降系數(shù)沉降系數(shù)單位單位則為則為:4.4S原核細(xì)胞核糖體的沉降常數(shù)為原核細(xì)胞核糖體的沉降常數(shù)為:7010-13用用沉降系數(shù)沉降系數(shù)單位單位則為則為:70S由沉降系數(shù)s，可根據(jù)斯維得貝格Svedberg方程計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量：(1)rRTsMDv斯維得貝格方程斯維得貝格方程R：摩爾氣體常數(shù)（：摩爾氣體常數(shù)（8.314J/(Kmol)）T：熱力學(xué)溫度（：熱力學(xué)溫度（K）s：沉降系數(shù)：沉降系數(shù)v：偏微比容（：偏微比容（蛋白質(zhì)溶于水時(shí)為蛋白質(zhì)溶于水時(shí)為0.74cm3/g）D:蛋白質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)（蛋白質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)（