頂空氣相色譜在藥物檢測(cè)中的應(yīng)用

1、海 南 大 學(xué)課程論文題 目：頂空氣相色譜在藥物研究的應(yīng)用 學(xué) 號(hào)： 20090412310018 姓 名： 潘成凱 年 級(jí)： 09級(jí) 學(xué) 院： 材料與化工學(xué)院 系 別： 生物工程系 專 業(yè)： 生物工程 指導(dǎo)教師： 趙富春老師 完成日期：2012 年 12 月 26 日 頂空氣相色譜在藥物研究的應(yīng)用09生工 潘成凱 20090412310018摘要:關(guān)鍵字：頂空氣相色譜分析法是對(duì)液體或固體試樣中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析的最有效方法，是色譜分析的一種特殊形式，這一方法從氣相色譜儀角度講是一種進(jìn)樣系統(tǒng)，即“頂空進(jìn)樣系統(tǒng)”。頂空進(jìn)樣就是樣品在一密閉的恒溫系統(tǒng)中，揮發(fā)組分氣液（氣固）兩相達(dá)到平衡時(shí)，從上部

2、空間取樣，然后用氣相色譜分析法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)取樣和進(jìn)樣方式的不同，頂空分析有靜態(tài)分析和動(dòng)態(tài)分析1。靜態(tài)頂空是指將樣品密封在頂空瓶子中，在一定的溫度下加熱，使得氣液（固）之間達(dá)到氣液平衡，然后取氣相部分進(jìn)入GC檢測(cè)。根據(jù)一次的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)而確定待檢測(cè)樣品中揮發(fā)性成分的含量。如果進(jìn)行多次取樣，直至樣品中揮發(fā)性組分完全萃取出來，這就是動(dòng)態(tài)頂空GC。靜態(tài)頂空氣相色譜簡單便宜，而動(dòng)態(tài)頂空氣相色譜價(jià)格昂貴，不易操作【2】。一、頂空氣相色譜簡介1.1原理頂空氣相色譜利用液(固)體中的揮發(fā)性組分i在密閉恒溫系統(tǒng)中達(dá)平衡后，氣相和液(固)相中揮發(fā)性組分比值恒定的原理，對(duì)平衡后液(固)體上部的蒸氣進(jìn)行氣相色譜分析。

3、頂空瓶中試樣上面的蒸汽壓相當(dāng)?shù)蜁r(shí)，峰面積Ai的大小與試樣上面的氣相中揮發(fā)性組分i的蒸汽壓pi成正比，在真實(shí)體系中，當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到平衡時(shí)，Ai=fi*pi=ki*xi（fi為校正因子，pi為i的飽和蒸汽壓，xi為組分i的摩爾分?jǐn)?shù)），通過頂空分析，可確定試樣中待測(cè)組分的含量【3】。靜態(tài)頂空氣相色譜是將適量樣品密封在留有充分空間的容器中，在一定溫度下放置一段時(shí)間使氣液（或氣固）兩相達(dá)到平衡，取容器上方的氣體進(jìn)行G C 分析。按達(dá)到氣液（或氣固）平衡的次數(shù)可分為一次頂空進(jìn)樣法和多次頂空進(jìn)樣法。按儀器模式可分為頂空氣體直接進(jìn)樣模式、平衡加壓采樣模式和加壓定容采樣進(jìn)樣模式【4】。動(dòng)態(tài)頂空氣相色譜是在未達(dá)到氣液

4、平衡狀況下進(jìn)行多次取樣，直至樣品的揮發(fā)性組分完全萃取出來為止，因此又稱氣相連續(xù)萃取。常用的方法是向樣品中不斷通入惰性氣體（氣體萃取劑），揮發(fā)性成分即隨萃取氣體從樣品溢出，然后由吸附裝置（捕集器）收集，解吸后進(jìn)入G C 儀分析，這種動(dòng)態(tài)頂空GC 通常稱為吹掃- 捕集頂空氣相。動(dòng)態(tài)頂空分析根據(jù)捕集模式可以分為吸附劑捕集模式和冷阱捕集模式5。1.2儀器構(gòu)造及部件頂空氣相色譜儀具有一般色譜儀的結(jié)構(gòu)，在進(jìn)樣系統(tǒng)有自己獨(dú)特的一面，其由載氣系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離柱、檢測(cè)系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng)5部分組成，載氣系統(tǒng)主要作用是使樣品能順利進(jìn)入分離柱，進(jìn)樣系統(tǒng)主要是負(fù)責(zé)將樣品汽化，分離柱是色譜的核心部件，決定了色譜的分離

5、性能，檢測(cè)系統(tǒng)用于對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)并轉(zhuǎn)化為信息進(jìn)行放大，溫度控制系統(tǒng)則對(duì)汽化室、分離室、檢測(cè)室進(jìn)行溫度的控制。頂空氣相色譜的進(jìn)樣系統(tǒng)需要一個(gè)恒溫浴的過程，使樣品汽化充滿取樣品，普通的氣相色譜是用進(jìn)樣針進(jìn)樣，進(jìn)樣體積在ul級(jí)別，樣品為液體；頂空進(jìn)樣進(jìn)樣體積在ml級(jí)別，進(jìn)入氣相色譜的為氣體?！?】贊1.3檢測(cè)方法、條件及其發(fā)展特點(diǎn)頂空氣相色譜頂空分析源于分析固體或液體頂部蒸氣相中的有機(jī)揮發(fā)性物質(zhì)，其出現(xiàn)早于氣相色譜法。1939年Harger等對(duì)水相中醇含量的測(cè)定為該方法的雛形。到1958年，頂空氣相色譜作為一種獨(dú)立的樣品處理技術(shù)和氣相色譜聯(lián)用進(jìn)行揮發(fā)物和半揮發(fā)物的分析方法出現(xiàn)報(bào)道【7】。早期恒溫浴的

6、溫度在120到150，現(xiàn)在已經(jīng)升到190甚至更高，擴(kuò)大了頂空進(jìn)樣器的應(yīng)用范圍。現(xiàn)在適合頂空氣相色譜法的檢測(cè)器有火焰離子化檢測(cè)器(FID)、熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)、氮磷檢測(cè)器 、火焰光度檢測(cè)器、電子捕獲檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器等。二、頂空氣相色譜在藥物研究的應(yīng)用1、頂空氣相色譜在中藥物質(zhì)分析中的應(yīng)用翁雪香等【8】利用頂空固相微萃取技術(shù)富集筒篙揮發(fā)性化合物，用手動(dòng)的固相微萃取裝置頂空萃取30 min, 萃取溫度為60。提取物在GC 進(jìn)樣口( 270 ) 脫附2 min, 載氣為氦氣，檢測(cè)器溫度280，然后進(jìn)行GC- MS 檢測(cè)分析。經(jīng)氣-質(zhì)聯(lián)用儀分析，共分離鑒定出25種化合物，大約占總峰面積99. 8%，

7、主要的化合物有蒎烯38.6%、羅勒烯19.3%、2-己烯醛9.0%，1，6，10-十五碳三烯6.4%、乙酸冰片酯4.30%、大根香葉烯2.7%和金合歡烯1.1%和2-乙基-4丁醇8%等。用氣相頂空技術(shù)得到的結(jié)果，與溶劑提取法得到的結(jié)果相比，是一種測(cè)定茼蒿易揮發(fā)性成分簡單、迅速、有效的方法。薛健等【9】采用頂空吹掃法進(jìn)行采樣，在氣相色譜220時(shí)進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2.0微升，分流比1：50，檢測(cè)室溫度200的條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果檢測(cè)出的100多個(gè)成分中有30多種化合物相同，而相差2倍以上的有15種化合物，相差5倍以上的有4種化合物，而其余成分不同，為頂空色譜在道地與非道地藥材的區(qū)別上提供了一定的理論指

8、導(dǎo)。魏寧漪【10】等利用頂空進(jìn)樣和固相微萃取進(jìn)樣，將40mg對(duì)照樣品置于20ml頂空樣品瓶中，加熱溫度為120，時(shí)間0.5小時(shí)，頂空時(shí)進(jìn)樣2ml，在270時(shí)進(jìn)行進(jìn)樣，載氣為氦氣，流速1ml/min，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，結(jié)果顯示，可以檢測(cè)出其中的樟腦、龍腦、己酸、苯酚、辛酸等摻假成分。徐娟華【11】采用頂空氣相譜法測(cè)定雞肝散中7種揮發(fā)油成分含量。以乙酸乙酯為溶劑, 頂空條件為平衡溫度90，時(shí)間為30min，氣體1ml自動(dòng)進(jìn)樣，氣相采用程序升溫法: 初始溫度60 , 以30/min升至90 ,再以5/min升至180 ; 進(jìn)樣口溫度200 , 檢測(cè)器溫度240。7種成分能較好分離, a- 蒎烯、B-

9、 蒎烯、L, 8- 桉葉醚、樟腦、芳樟醇、乙酸龍腦酯和龍腦平均回收率分別為96. 6%、97.0%、97. 8%、99.9%、96.5%、97.4%、97.1%.由此可知，頂空氣相色譜能夠很好的對(duì)中藥材中的揮發(fā)油進(jìn)行檢測(cè)。于生等22于150 對(duì)藥材粉末加熱60m in 后取頂空氣體0.5ml, 進(jìn)樣口200，F(xiàn)ID220檢測(cè)。通過對(duì)10批貓爪草藥材色譜圖的統(tǒng)計(jì)分析, 標(biāo)定了12個(gè)共有峰。認(rèn)為此方法簡便, 穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好, 具有可操作性。陳建偉 23 在頂空溫度95，平衡10 min 后進(jìn)入色譜，進(jìn)樣口溫度為180，F(xiàn)ID在280進(jìn)行檢測(cè)，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種中藥的頂空氣相色譜特征指紋圖各異, 貯

10、藏4年的牡丹皮僅含微量的丹皮酚。頂空氣相色譜法在鑒定芳香類中藥的品質(zhì)及其質(zhì)量監(jiān)控方面, 具有簡便、快速、準(zhǔn)確及專屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。2、頂空氣相色譜在藥物溶劑殘留分析中的應(yīng)用梁祈【12】等采用頂空氣相色譜法測(cè)定了頭抱氨節(jié)中有機(jī)殘留溶劑甲醇的含量，用0.5 m ol/L氫氧化鈉溶液為溶劑制備供試品溶液, 頂空熱平衡溫度: 80 , 采樣針溫度: 105 , 傳輸管溫度: 110 , 熱平衡時(shí)間: 30 min, 壓力平衡時(shí)間: 0. 3 min, 進(jìn)樣時(shí)間: 0. 03 min。在120時(shí)進(jìn)樣，采用FID檢測(cè)器，溫度為280。結(jié)果顯示，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可作為頭抱氨節(jié)中甲醇?xì)埩舻臋z測(cè)方法。黃勇【13

11、】等用頂空氣相色譜法同時(shí)測(cè)定赤芍提取物中2種殘留有機(jī)溶劑，頂空平衡溫度為70，平衡時(shí)間40 m in。色譜柱溫60，載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度為220，進(jìn)樣體積0.5ml，得出提取物中乙醇、正丁醇?xì)埩魷y(cè)定結(jié)果,含乙醇不得過1 000 g /g, 正丁醇不得過20g /g, 遠(yuǎn)低于ICH 規(guī)定0.5% ( 5 000ug /g)的限度要求。頂空進(jìn)樣避免了難揮發(fā)物質(zhì)對(duì)色譜柱的污染以及一些不必要的干擾, 又增加了揮發(fā)性被分析物的靈敏度, 非常適合于揮發(fā)性有機(jī)溶劑殘留分析。魏晶晶等【14】利用頂空進(jìn)樣，結(jié)合毛細(xì)管色譜柱，對(duì)常用的在生產(chǎn)藥物機(jī)制被過程中常用到的27種有機(jī)揮發(fā)性化合物進(jìn)行測(cè)定，頂空條件為80恒

12、溫震蕩30min，以1：1的分流比進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為220，檢測(cè)器溫度300，結(jié)果顯示分離度絕大多數(shù)均大于1.5，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，精密度良好。何偉15 采用頂空氣相色譜法測(cè)定銀杏葉提取物中有機(jī)溶劑乙醇的殘留量。采用CP- 624色譜柱,載氣為氮?dú)? 柱溫采取程序升溫的方法; FID 檢測(cè)器溫度250 ; 進(jìn)樣口溫度180 。結(jié)果顯示乙醇在20. 6 412.0g /mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系, r= 0. 9996平均回收率為99.85%, RSD 為1.62%, 最低檢測(cè)限為13ng。認(rèn)為該方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確, 可用于銀杏葉提取物中乙醇?xì)埩袅康臏y(cè)定。劉敬蘭等16利用頂空氣相色

13、譜法測(cè)定了維生素B12 中丙酮溶劑的殘留量,其色譜條件為10 % 二硝基對(duì)苯二甲酸封端的聚乙二醇20 M (FFAP 2 m x 3 m m ) 不銹鋼柱, 柱溫80 , 氣化室及檢測(cè)器溫度為150 ; 載氣流量5 0 m L/min。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其最佳平衡時(shí)間為60 m in , 最佳平衡溫度為60 , 在0300 ug 的范圍內(nèi)峰面積和丙酮含量間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。潘雪萍【17】采用頂空氣相色譜法測(cè)定鹽酸托泊替康中的殘留有機(jī)溶劑。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，頂空的最佳條件為溫度80，最佳平衡時(shí)間為30min，氣相的進(jìn)樣口溫度為250，流速，分流比為，柱溫箱溫度，檢測(cè)器溫度。測(cè)定批樣品，均未檢出乙腈、乙酸

14、乙酯和二氧六環(huán)，檢出了甲醇和丙酮，各殘留量符合要求。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法簡單、快捷、靈敏，可有效用于該藥有機(jī)溶劑殘留量的控制。張宏等 26 測(cè)定水飛薊提取物中的正己烷和醋酸乙酯的殘留量。試驗(yàn)采用FFAT ( 2- 硝基對(duì)苯二甲酸封端的聚乙二醇20M 柱)石英毛細(xì)管柱, 程序升溫方式, 頂空條件為平衡溫度為130 e , 平衡時(shí)間30 m in,測(cè)定結(jié)果表明水飛薊提取物中兩種溶劑殘留量均符合要求。王騰等 30 采用HP- 5色譜柱, 柱溫80 , 頂空瓶加熱溫度80 , 平衡15 m in, 以正丁醇為內(nèi)標(biāo)測(cè)定注射用銀杏葉( 凍干)中甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯殘留量。該方法線性良好, 精密

15、度、重現(xiàn)性RSD 均小于5%, 平均回收率在93. 06% 113. 78%, 四種溶劑殘留量均符合要求。3、頂空氣相色譜法在中藥外源性雜質(zhì)引入的檢測(cè)廖遠(yuǎn)熹等 18 采用靜態(tài)頂空氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒別市售柴胡是否經(jīng)硫黃熏制。將2g樣品置于10ml頂空瓶，試驗(yàn)采用HP- 5MS毛細(xì)管色譜柱, 程序升溫方式, 進(jìn)樣口溫度為200，以50比1的分流比進(jìn)樣，以氦氣為載氣, 頂空溫度120 , 預(yù)熱30m in。結(jié)果表明: 與未經(jīng)硫黃熏制的陰性樣品比較, 9種市售柴胡中有7種經(jīng)過了不同程度的熏制, 該方法可廣泛應(yīng)用于中藥材硫黃的檢出。4、頂空氣相色譜法測(cè)定使用大孔吸附樹脂后的殘留物袁海龍【19】等

16、采用頂空進(jìn)樣方式, 氫火焰( FID)檢測(cè)器, 利用程序升溫方式, 以氦氣為載氣, 頂空溫度為60 , 加熱時(shí)間為30 m in,氣相色譜進(jìn)樣口溫度為200，檢測(cè)器溫度240， 用以測(cè)定經(jīng)D101大孔吸附樹脂分離的茵陳蒿有效部位中可能含有的正己烷、苯、甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二苯乙烯等殘留物及裂解產(chǎn)物。結(jié)果表明該中藥有效部位中未檢測(cè)出以上7種殘留物. 采用頂空進(jìn)樣, 取得了很好的效果。鄧海星【20】等采用頂空毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定胡黃連提取物中大孔樹脂殘留物，在80下平衡40 m in, 采用頂空進(jìn)樣方式，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器,溫度270 ; 進(jìn)樣器250 , 以5比1的分流比進(jìn)

17、樣。結(jié)果顯示7種殘留物的峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。姚干等21 用頂空溫度85 , 以二甲亞砜為溶劑, 對(duì)采用HPD450大孔吸附樹脂分離純化所得的梔子提取物中可能含有的正己烷、苯、正庚烷、甲苯等殘留物進(jìn)行測(cè)定; 再用頂空溫度85 e , 以1% 甲醇為溶劑, 測(cè)定梔子提取物中可能含有的二甲苯、苯乙烯、1, 4- 二乙基苯和1, 2- 二乙基苯等殘留物。結(jié)果表明, 三批梔子提取物均未檢出上述8種殘留物, 最低檢測(cè)限在50ng /m l以下。許勇【24】等采用頂空進(jìn)樣毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定燈盞花素提取物中大孔樹脂有機(jī)溶劑殘留物，在頂空溫度90下平衡30min，進(jìn)樣口240，300FID檢測(cè)，結(jié)果顯

18、示，待測(cè)物正己烷、苯、甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙烯苯與內(nèi)標(biāo)物正丁醇獲得了較好的分離。8 種有機(jī)殘留物，結(jié)果均未檢出。李麗敏【25】等用頂空溫度95平衡30min，氣相進(jìn)樣口溫度240，柱溫60，檢測(cè)器溫度為300對(duì)三七葉苷中大孔樹脂有機(jī)溶劑殘留物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，沒有殘留物剩余。此法簡單高效，可作為測(cè)定方法。王焱27在平衡溫度85下加熱55min，進(jìn)樣口溫度180，F(xiàn)ID 檢測(cè)器180，柱溫40，載氣為氮?dú)鈱?duì)加參片中大孔樹脂有機(jī)殘留溶劑。結(jié)果表明各殘留溶劑均未檢出，符合限度要求。該方法適用于中藥復(fù)方制劑加參片中大孔樹脂殘留溶劑的控制。另外, 鄒亮等 28 測(cè)定了

19、苦蕎麥總黃酮提取物中可能由AB - 8大孔樹脂中殘留的正己烷、苯、甲苯、對(duì)二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、乙苯和苯乙烯。楊玲等 29 測(cè)定黃芩提取物中可能含有的D-101大孔吸附樹脂帶來的正己烷、苯、甲苯、二甲苯、二乙苯、苯乙烯、二乙烯苯等殘留物。三、前景頂空氣相色譜法是一種對(duì)藥物成分檢測(cè)的快速而簡便的分析方法, 該方法具有較高的靈敏度和分析速度, 對(duì)分析人員和環(huán)境危害小, 操作簡便, 是一種符合綠色分析化學(xué)要求的分析手段。為了保證藥品的安全性, 中藥材提取物中有機(jī)溶劑殘留量的測(cè)定就成為研究者關(guān)注的問題, 也是藥品質(zhì)量的檢測(cè)的重點(diǎn)關(guān)注的問題, 對(duì)這些溶劑的測(cè)定在中國藥典2 005 版附錄作原則性規(guī)定。隨著分析儀器的發(fā)展和分析技術(shù)的提高, 頂空氣相色譜在藥物分析中的應(yīng)用將會(huì)越來越廣泛。參考文獻(xiàn)：【1】1Kolb B,Ettre L S.Static headspace-gas chromatography:theory and practiceM.New Jersey:John Wiley&Sons,2006【2】張軍 車海先 ，淺議頂空氣相色譜【J】，食品安全