3酶的分離純化2

1、是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親子大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)等）的不同，使各組分和力和分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩在兩相中的分布程度不同而達到分離。相中的分布程度不同而達到分離。層析分離中一個相是固定的層析分離中一個相是固定的, ,稱為固定相稱為固定相; ;另一個相是流動的另一個相是流動的, ,稱為流動相稱為流動相; ;各組分移動速度步同各組分移動速度步同, ,使不同組分分純化使不同組分分純化; ;層析分離設(shè)備簡單層析分離設(shè)備簡單, ,操作容易操作容易; ;層析分離層析分離層析柱層析柱

2、層析方法分離依據(jù)層析方法分離依據(jù)吸附層析吸附力不同吸附層析吸附力不同分配層析各組分在兩相中分配系數(shù)不同分配層析各組分在兩相中分配系數(shù)不同離子交換層析離子交換劑上解離基團對離子親和力不同離子交換層析離子交換劑上解離基團對離子親和力不同凝膠層析各組分相對分子量不同凝膠層析各組分相對分子量不同親和層析生物分子與配基間專一又可逆親和力親和層析生物分子與配基間專一又可逆親和力層析聚焦等電特性與離子交換層析特性結(jié)合層析聚焦等電特性與離子交換層析特性結(jié)合一個相中的物質(zhì)在兩相界面上密集現(xiàn)象稱為吸附；一個相中的物質(zhì)在兩相界面上密集現(xiàn)象稱為吸附；利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及利用固定相的固體吸

3、附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。吸附產(chǎn)生原因：固體表面分子與固體內(nèi)部分子受的作用力吸附產(chǎn)生原因：固體表面分子與固體內(nèi)部分子受的作用力不同；主要是范德華力。不同；主要是范德華力。特點：特點：適合分離不同種類的化合物適合分離不同種類的化合物( (醇類和芳香烴）。醇類和芳香烴）。不同物質(zhì)吸附力、解析力不同，移動距離不同，而分離。不同物質(zhì)吸附力、解析力不同，移動距離不同，而分離。吸附層析法吸附層析法:利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，而使混合液中各組分分離。力不同，而使混合液中各組

4、分分離。（液（液-固色譜法，固色譜法，lsc）吸附層析原理吸附層析原理吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，與待分離吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，與待分離物質(zhì)的極性官能團作用。物質(zhì)的極性官能團作用。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等石等; ;常用于酶分離純化的：硅藻土、氯化鋁、磷酸常用于酶分離純化的：硅藻土、氯化鋁、磷酸鈣、羥基磷灰石、活性碳。鈣、羥基磷灰石、活性碳。羥基羥基磷灰石（羥基羥基磷灰石（haha）caca1010(po(po4 4) )6 6.(oh).(oh)2 2,可用于可用于分離蛋白質(zhì)與核酸。分離蛋白質(zhì)與核酸。其表

5、面有其表面有caca2+2+和和popo4 43-3-兩種帶電基團；酸性和中性蛋白質(zhì)可與兩種帶電基團；酸性和中性蛋白質(zhì)可與caca2+2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與popo4 43-3-結(jié)合。結(jié)合。haha柱層析最重要的用柱層析最重要的用途之一是分離單鏈途之一是分離單鏈dnadna和雙鏈和雙鏈dnadna，因為它對雙鏈因為它對雙鏈dnadna的親和的親和力大于單鏈力大于單鏈dnadna。吸附劑吸附劑分配層析法（液分配層析法（液-液層析法，液層析法，llc）原理：原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的分配系數(shù)的不同（固定相和流動相

6、）之間的分配系數(shù)的不同而達到分離各組分的目的。固定相液體均勻而達到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動相流過固定相。覆蓋于載體表面，流動相流過固定相。原理原理: :根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子的親和力不同而達到分離的目的。的親和力不同而達到分離的目的。酶是兩性物質(zhì)，當(dāng)溶液的酶是兩性物質(zhì)，當(dāng)溶液的phph值大于酶的等電點值大于酶的等電點時，酶分子帶負電荷，可用陰離子交換劑進行時，酶分子帶負電荷，可用陰離子交換劑進行層析分離，反之，用陽離子交換劑。層析分離，反之，用陽離子交換劑。離子交換樹脂：離子交換樹脂：大孔徑離子交換樹脂大孔徑離子交換

7、樹脂。離子交換纖維素：離子交換纖維素：deae-deae-纖維素，纖維素，ae-ae-纖維素，纖維素，cmccmc（羧甲基纖維素）羧甲基纖維素）離子交換凝膠：離子交換凝膠：deaedeae葡聚糖凝膠、葡聚糖凝膠、deaedeae聚丙烯酰胺凝膠等。聚丙烯酰胺凝膠等。離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團的基團. .含有酸性可解離基團的稱為含有酸性可解離基團的稱為陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂，可解離出，可解離出h h+ +，含有堿性可解離基團的稱為含有堿性可解離基團的稱為陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂，可解離出，可解離出

8、ohoh- -。離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理+若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與h+h+發(fā)生交換而結(jié)發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負電荷的物質(zhì)可與合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負電荷的物質(zhì)可與oh-oh-發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下來，達到分離適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。純化的目的。+1 1、離子交換

9、劑的處理與裝柱；、離子交換劑的處理與裝柱；2 2、上柱；、上柱；3 3、冼脫和收集；、冼脫和收集； 4 4、離子交換劑的再生。、離子交換劑的再生。、離子交換層析的主要操作過程、離子交換層析的主要操作過程、離子交換劑的選擇與處理、離子交換劑的選擇與處理是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)；是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)；引入不溶性母體的活性基團可以是酸性基團，作為陽引入不溶性母體的活性基團可以是酸性基團，作為陽離子交換劑；也可是堿性基團，作為陰離子交換劑；離子交換劑；也可是堿性基團，作為陰離子交換劑；平衡常數(shù)；平衡常數(shù)；（）離子交換劑的選擇；（）離子交換劑的選擇；（）離子交換劑的處理。（）

10、離子交換劑的處理。back概念概念（排阻層析，分子篩層析）：混合物隨流動相流經(jīng)裝排阻層析，分子篩層析）：混合物隨流動相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時，混合物中各物質(zhì)因分子大小有凝膠作為固定相的層析柱時，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。不同而被分離的技術(shù)。凝膠層析是凝膠層析是6060年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡便的分離技年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡便的分離技術(shù)。目前它已被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)及醫(yī)藥術(shù)。目前它已被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)及醫(yī)藥學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。從廣義上說凝膠是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子從廣義上說凝膠是一類具有

11、三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，如天然物質(zhì)中的馬鈴薯淀粉及瓊脂糖凝膠，人工合聚合物，如天然物質(zhì)中的馬鈴薯淀粉及瓊脂糖凝膠，人工合成品的葡聚糖凝膠及帶離子交換基團的葡聚糖凝膠等。制成成品的葡聚糖凝膠及帶離子交換基團的葡聚糖凝膠等。制成顆粒狀，裝進凝膠層析柱使用。顆粒狀，裝進凝膠層析柱使用。設(shè)備簡單，操作方便（不需經(jīng)過再生處理可反復(fù)使用）。不設(shè)備簡單，操作方便（不需經(jīng)過再生處理可反復(fù)使用）。不需要有機溶劑，以及對高分子物質(zhì)有很高的分離效果，適于需要有機溶劑，以及對高分子物質(zhì)有很高的分離效果，適于不同分子量的各種物質(zhì)。不同分子量的各種物質(zhì)。凝膠顆粒凝膠顆粒凝膠顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，加凝膠

12、顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，加入欲分離的混合物，大量蒸鎦水或其它稀入欲分離的混合物，大量蒸鎦水或其它稀溶液洗柱溶液洗柱; ;分子量最大的物質(zhì)不能進入凝膠網(wǎng)孔而沿分子量最大的物質(zhì)不能進入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆凝膠顆 粒間的空隙最先流出柱外。分子量粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質(zhì)因能進入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，最小的物質(zhì)因能進入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，最后流出柱外。流速緩慢，最后流出柱外。整個過程和過濾相似，故又名凝膠過濾、整個過程和過濾相似，故又名凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾等。由于物質(zhì)凝膠滲透過濾、分子篩過濾等。由于物質(zhì)在分離過程中的阻滯減速現(xiàn)象，有人也稱在分離過程中的阻滯減速現(xiàn)象，

13、有人也稱之為阻滯擴散層析、排阻層析等。之為阻滯擴散層析、排阻層析等。原理：原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。度較慢，最后被洗脫出來。k kd d：分配系數(shù)，分配系數(shù)，k kd

14、d小的物質(zhì)先流出。小的物質(zhì)先流出。veve：冼脫體積，表示某一組分從進入導(dǎo)析柱到流出冼脫體積，表示某一組分從進入導(dǎo)析柱到流出 液中出現(xiàn)該組分高峰時，所需的冼脫液的體積。液中出現(xiàn)該組分高峰時，所需的冼脫液的體積。vovo：外體積。層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積外體積。層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積vivi：內(nèi)體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和。內(nèi)體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和。表征式表征式討論討論kd=1kd=00kd0f=0h+h+oh-遷移原理圖遷移原理圖因素總結(jié)因素總結(jié)（1 1）電場強度）電場強度e: e: 指每厘米的電壓降；指每厘米的電壓降；（2 2）溶液）溶液php

15、h值值: :決定了顆粒分子所帶的凈電荷；決定了顆粒分子所帶的凈電荷；（3 3）電滲）電滲: :溶液對固體支持物的相對泳動；溶液對固體支持物的相對泳動；此外此外, ,緩沖液的黏度、溫度對顆粒的泳動速度也有緩沖液的黏度、溫度對顆粒的泳動速度也有影響。影響。用途（酶工程領(lǐng)域）用途（酶工程領(lǐng)域）酶的純度鑒定酶的純度鑒定; ;酶分子量測定酶分子量測定; ;酶等電點測定酶等電點測定; ;小批量酶的分離純化小批量酶的分離純化. .水平電泳儀水平電泳儀垂垂直直電電泳泳槽槽垂直管型盤狀電泳；垂直管型盤狀電泳；垂直板型電泳。垂直板型電泳。定義定義以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支撐物以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作

16、為支撐物（通常是聚丙烯酰胺凝膠）的電泳技術(shù)。（通常是聚丙烯酰胺凝膠）的電泳技術(shù)。形狀形狀單面垂直電泳槽單面垂直電泳槽 水平板式電泳槽水平板式電泳槽垂直板式電泳槽垂直板式電泳槽 聚丙烯酰胺凝膠的制備（操作）聚丙烯酰胺凝膠的制備（操作）電泳電泳染色染色脫色脫色 定性、定量定性、定量（測量電泳遷移率）（測量電泳遷移率）制備凝膠制備凝膠go電泳圖譜電泳圖譜膠膜放入底座膠膜放入底座 膠膜固定在底座上膠膜固定在底座上 加膠加膠放電梳放電梳 制制膠膠完成取出完成取出 放入電泳槽中放入電泳槽中 安裝防護罩安裝防護罩 整套安裝完畢準(zhǔn)備電泳整套安裝完畢準(zhǔn)備電泳 制膠圖示制膠圖示 back 凝膠的物理性質(zhì)如機械強度

17、、彈性、透明度和粘著度都取決凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（于凝膠總濃度（t t）和和acracr與與bisbis兩者之比。兩者之比。凝膠總濃度（凝膠總濃度（t t）和交和交聯(lián)度（聯(lián)度（c c）的計算公式分別為：的計算公式分別為：t= c= t= c= 凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔凝膠濃度越大，孔徑越小徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。軟，不易操作，也易斷裂。當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)

18、度為5%5%時，時，凝膠具有最小孔徑，凝膠具有最小孔徑，超過超過5%5%或低于或低于5%5%時凝膠孔徑都要增大。時凝膠孔徑都要增大。 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系acr（g）+bis（g）v（ml）x100%acr（g）+bis（g）bis（g）x100% 在濃度為在濃度為7.5%7.5% 的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把滿意的分離效果。因此，把濃度為濃度為7.5%7.5% 凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。對于。對于一個未知樣品，常用一個未知樣品，常用7.5%7.5%的標(biāo)準(zhǔn)膠或的標(biāo)準(zhǔn)膠或4%-

19、10%4%-10% 的凝膠梯度來測試，的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。而后選出適宜的凝膠濃度。 用于研究大分子核酸的凝膠多為用于研究大分子核酸的凝膠多為2.4%2.4%的大孔凝膠，此時凝的大孔凝膠，此時凝膠太軟，不易操作，可加入膠太軟，不易操作，可加入0.5%0.5%瓊脂糖，或在瓊脂糖，或在3%3%凝膠中加入凝膠中加入20%20%蔗糖以增加機械強度而又不影響凝膠孔徑大小。蔗糖以增加機械強度而又不影響凝膠孔徑大小。back系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面： 1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑

20、的濃縮膠，下的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。層為小孔徑的分離膠。 2.緩沖液離子組成及各層凝膠的緩沖液離子組成及各層凝膠的phph不同。不同。電極緩沖液為電極緩沖液為ph8.3ph8.3的的tris-tris-甘氨酸緩沖液，甘氨酸緩沖液，濃縮膠為濃縮膠為ph6.7ph6.7的的tris-hcltris-hcl緩沖液，而分離緩沖液，而分離膠為膠為ph8.9ph8.9的的tris-hcltris-hcl緩沖液。緩沖液。 3.在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。 在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，物理效應(yīng)，即

21、樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高.8.38.38.96.7凝膠層由上至下分別為：樣品膠、濃縮膠、分離膠凝膠層由上至下分別為：樣品膠、濃縮膠、分離膠樣品膠樣品膠包含樣品的大孔徑凝膠包含樣品的大孔徑凝膠濃縮膠濃縮膠用于樣品濃縮成導(dǎo)線的大孔徑凝膠，用于樣品濃縮成導(dǎo)線的大孔徑凝膠，不含樣品，其它與樣品膠一樣不含樣品，其它與樣品膠一樣分離膠分離膠使樣品中各組分電泳分離的使樣品中各組分電泳分離的孔徑較小的凝膠孔徑較小的凝膠backsds-sds-凝膠電泳凝膠

22、電泳在聚丙烯酰胺凝膠制備時，加入在聚丙烯酰胺凝膠制備時，加入1 12%2%的的sdssds（十二烷基硫酸鈉）而成。十二烷基硫酸鈉）而成。19671967，shapiroshapiro等發(fā)現(xiàn)。等發(fā)現(xiàn)。前述的凝膠電泳中，遷移率主要取決前述的凝膠電泳中，遷移率主要取決于蛋白電荷及分子大小及形狀；于蛋白電荷及分子大小及形狀；sds-sds-凝膠電泳中，電泳遷移率取決于凝膠電泳中，電泳遷移率取決于蛋白分子量大小，而與其分子形狀及蛋白分子量大小，而與其分子形狀及其所帶電荷無關(guān)，故該方法主要用于其所帶電荷無關(guān)，故該方法主要用于測定蛋白質(zhì)或酶的分子量。測定蛋白質(zhì)或酶的分子量。兩種兩種不同不同形式形式的電的電泳

23、泳為什么為什么sds-sds-凝膠電泳會不受蛋白分子所帶電荷及分子形狀影響呢？凝膠電泳會不受蛋白分子所帶電荷及分子形狀影響呢？sdssds陰離子帶負電荷，陰離子帶負電荷，sds-sds-蛋白質(zhì)復(fù)合物上結(jié)合大量陰離子掩蛋白質(zhì)復(fù)合物上結(jié)合大量陰離子掩蓋了蛋白質(zhì)間原來的電荷差別；蓋了蛋白質(zhì)間原來的電荷差別；sdssds與蛋白結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，在水溶液中變成長橢與蛋白結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，在水溶液中變成長橢圓形，短軸均為圓形，短軸均為18a18a，長軸與蛋白分子量成正比。，長軸與蛋白分子量成正比。ief在電泳系統(tǒng)中加入兩性電解質(zhì)載在電泳系統(tǒng)中加入兩性電解質(zhì)載體（在電場中能夠形成一個由陽體（在電場中能夠形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高的極到陰極連續(xù)增高的phph梯度），梯度），當(dāng)不同蛋白質(zhì)等進入該體系中即當(dāng)不同蛋白質(zhì)等進入該體系中即移動（聚焦）到與其等電點相當(dāng)移動（聚焦）到與其等電點相當(dāng)?shù)牡膒hph位置上，從而使不同等電點位置上，從而使不同等電點的蛋白質(zhì)得以分離。的蛋白質(zhì)得以分離。ief原理原理ph連續(xù)連續(xù)增高增高pi點點（1 1）分辯率高（等電點僅差）分辯率高（等電點僅差0.010.02ph0.