補(bǔ)陽還五湯對(duì)Cav-1---小鼠腦缺血模型PI3K、Akt、PTEN表達(dá)的影響

1、    補(bǔ)陽還五湯對(duì)cav-1-/-小鼠腦缺血模型pi3k、akt、pten表達(dá)的影響    陳博威 周勝?gòu)?qiáng) 易健 張文將 劉柏炎 摘要：目的  觀察補(bǔ)陽還五湯對(duì)cav-1-/-小鼠腦缺血模型pi3k、akt、pten表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法  將野生型小鼠（wt）及cav-1-/-小鼠（ko）隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組與補(bǔ)陽組。采用大腦中動(dòng)脈栓塞法制備腦缺血模型，干預(yù)10 d后運(yùn)用ayelet levy 14分評(píng)分法觀察小鼠神經(jīng)功能評(píng)分。免疫組化和qrt-pcr分別檢測(cè)小鼠腦組織pi3k、akt、pten蛋白和mrna的

2、表達(dá)。結(jié)果  與假手術(shù)組比較，各模型組小鼠均出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能障礙（p<0.01），且pi3k、akt蛋白和mrna表達(dá)明顯升高（p<0.01），pten蛋白和mrna表達(dá)明顯降低（p<0.01），wt模型組小鼠腦組織pi3k、akt、pten蛋白和mrna表達(dá)更顯著，且神經(jīng)功能評(píng)分優(yōu)于ko模型組（p<0.01，p<0.05）;wt補(bǔ)陽組小鼠腦組織pi3k、akt、pten蛋白和mrna的調(diào)控程度及神經(jīng)功能恢復(fù)程度均優(yōu)于wt模型組和ko補(bǔ)陽組（p關(guān)鍵詞：補(bǔ)陽還五湯;腦缺血;pi3k/akt信號(hào)通路;cav-1基因敲除;小鼠中圖分類號(hào)：r285.5 

3、;   文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a    文章編號(hào)：1005-5304（2020）04-0035-06doi：10.3969/j.issn.1005-5304.201910455effects of buyang huanwu decoction on expressions of pi3k， akt， ptenin cav-1-/- mice after cerebral ischemiachen bowei1， zhou shengqiang2， yi jian3， zhang wenjiang1，4， liu baiyan1，41. hunan university o

4、f chinese medicine， changsha 410208， china;2. affiliated hospital of hunan provincial academy of chinese medicine， changsha 410006， china;3. the first affiliated hospital of hunan university of chinese medicine， changsha 410007， china;4. yiyang medical college， yiyang 413000， chinaabstract： objectiv

5、e to observe the effects of buyang huanwu decoction on expressions of pi3k， akt and pten after cerebral ischemia in cav-1-/-mice; to discuss its possible mechanism. methods wild type mice （wt） and cav-1-/-mice （ko） were randomly divided into sham-operation group， model group and buyang huanwu decoct

6、ion group. cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion. after 10 days of intervention， the neurological function scores of each group were observed by ayelet levy 14 points. immunohistochemistry and qrt-pcr were used to detect the expressions of pi3k， akt， pten protei

7、n and mrna. results compared with sham-operation group， there were obvious neurological dysfunction in each model group （pkeywords： buyang huanwu decoction; cerebral ischemia; pi3k/akt signaling pathway; cav-1 gene knockout; mice缺血性腦血管疾病因其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率給社會(huì)、家庭及個(gè)人帶來沉重的痛苦和負(fù)擔(dān)1。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，cav-1在腦缺血損傷中可抑制炎

8、癥反應(yīng)、降低缺血側(cè)半暗帶自噬及促進(jìn)血管新生2-4，達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)的作用。pi3k/akt信號(hào)通路是一條能調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及自噬的經(jīng)典通路，對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用5。有研究表明，cav-1可通過調(diào)控pi3k/akt通路治療疾病6-7，但cav-1是否調(diào)控pi3k/akt通路對(duì)腦缺血后腦保護(hù)作用產(chǎn)生影響，迄今未見報(bào)道。補(bǔ)陽還五湯為治療缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的經(jīng)典名方，其療效已被臨床證實(shí)8。本研究以cav-1基因敲除小鼠作為研究對(duì)象，通過觀察腦缺血小鼠神經(jīng)功能評(píng)分與pi3k/akt通路相關(guān)指標(biāo)的蛋白與mrna變化，探討補(bǔ)陽還五湯干預(yù)腦缺血小鼠的作用機(jī)制。1  實(shí)驗(yàn)材料1.1 

9、 動(dòng)物健康雄性cav-1-/-小鼠（ko）與同源野生型c57（wt）小鼠各40只。其中cav-1-/-小鼠購(gòu)自美國(guó)jackson laboratory，批號(hào)2909619，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心自行繁衍，均經(jīng)pcr鑒定為cav-1基因敲除9，自由攝食飲水。1.2  藥物補(bǔ)陽還五湯（黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，川芎3 g，紅花3 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，地龍3 g），飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。常規(guī)煎煮后濃縮至含2 g原藥材/ml，冷藏備用。1.3  主要試劑與儀器pi3k抗體、akt抗體、pten抗體、sabc-pod試劑盒（武漢博士德公司，批號(hào)依次為ba

10、1353-1、ba1512、bm4114、sa1022）。eg1150h石蠟包埋機(jī)（德國(guó)萊卡公司），rm2235切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司），bx71顯微鏡（日本奧林巴斯公司），trizol reagent（美國(guó)life technologies公司），rever taid first strand cdna synthesis kit（美國(guó)thermo公司），pcr引物（上海生工合成），pcr擴(kuò)增儀（美國(guó)bio-rad公司），核酸水平電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司），核酸蛋白濃度測(cè)定儀（英國(guó)bio-drop公司）。2  實(shí)驗(yàn)方法2.1  分組、造模與給藥將ko組和wt組按隨機(jī)

11、數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組及補(bǔ)陽組，運(yùn)用大腦中動(dòng)脈栓塞法復(fù)制腦缺血模型，每組12只。將小鼠麻醉后固定，取頸正中切口，游離左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，依次結(jié)扎頸總、頸外動(dòng)脈。于頸總動(dòng)脈分叉部下方0.20.3 cm處剪一小口，將魚線通過頸總動(dòng)脈，插入頸內(nèi)動(dòng)脈，遇輕微阻力后停止進(jìn)線，深度（7.5±0.5）mm，固定魚線并逐層縫合。假手術(shù)組僅切開皮膚、分離頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈后即縫合。術(shù)后2 h參照longa等105分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。分值在13分表明造模成功，予以納入研究。補(bǔ)陽組術(shù)后2 h給藥，給藥劑量為每日18.5 g/kg（按70 kg成人與動(dòng)物體質(zhì)量藥量折算表換算）補(bǔ)陽還五湯藥液，灌胃體

12、積按0.2 ml/10 g體質(zhì)量，模型組和假手術(shù)組動(dòng)物均給予等體積蒸餾水。每日1次，連續(xù)10 d。2.2  檢測(cè)指標(biāo)2.2.1  神經(jīng)功能評(píng)分運(yùn)用ayelet levy 14分評(píng)分法11評(píng)估神經(jīng)功能。提住尾巴將小鼠逐漸提高：前肢屈曲計(jì)1分，后肢屈曲計(jì)1分，30 s內(nèi)頭移動(dòng)與縱軸形成角度>10°計(jì)1分;將大鼠置于地面：正常爬行計(jì)0分，無法直線爬行計(jì)1分，沿患側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分，患側(cè)跌倒計(jì)3分;梁平衡測(cè)試：靜態(tài)姿勢(shì)下可平衡計(jì)0分，抓握梁邊計(jì)1分，抱住梁、有一肢體掉落計(jì)2分，抱住梁、有兩肢體掉落，或在梁上旋轉(zhuǎn)（>60 s）計(jì)3分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>

13、40 s）計(jì)4分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>20 s）計(jì)5分，跌落且沒有試圖保持平衡或抓梁（2.2.2  免疫組化檢測(cè)蛋白表達(dá)小鼠處死后，4%多聚甲醛固定大腦，脫水，常規(guī)包埋，切片，厚度約4 m，依次烤片、脫蠟水化，3%過氧化氫去離子水滅活，熱修復(fù)抗原，bsa封閉液封閉，適量一抗4 冰箱過夜，pbs沖洗后二抗孵育，再次pbs沖洗，滴加sabc孵育，最后dab顯色并梯度脫水，透明，封片。每只大鼠取5張切片，光學(xué)顯微鏡（200倍）鏡下觀察，運(yùn)行image pro plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)。另因一抗特性不同，pten在dab染色后再用蘇木素復(fù)染，光學(xué)顯微鏡（200

14、倍）鏡下觀察，運(yùn)行imagepro plus6.0圖像分析軟件計(jì)算平均光密度。2.2.3  qrt-pcr檢測(cè)mrna表達(dá)從引物銀行下載基因序列，用primer premier 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。運(yùn)用trizol法提取腦組織總rna;檢測(cè)rna濃度及質(zhì)量;兩步法反轉(zhuǎn)錄cdna;pcr反應(yīng)：預(yù)變性95 、2 min，變性95 、15 s，退火58.260.8 ，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)程序：95 、15 s，60 、15 s，溫度緩慢上升（20 min）。-actin為內(nèi)參基因，用2-ct進(jìn)行相對(duì)定量，表示該基因相對(duì)表達(dá)量。ct值=基因

15、ct值-內(nèi)參ct值，ct值=實(shí)驗(yàn)組ct值-對(duì)照組ct值。3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用spss21.0統(tǒng)計(jì)軟件及graphpad prism 8作圖軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以x±s表示，符合正態(tài)性分布，組間比較采用方差分析。p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4  結(jié)果4.1  補(bǔ)陽還五湯對(duì)模型小鼠神經(jīng)功能的影響假手術(shù)組小鼠無神經(jīng)功能障礙;各模型組小鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能障礙（p<0.01），且ko比wt神經(jīng)功能損傷更嚴(yán)重（p<0.05）;補(bǔ)陽組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分較模型組明顯降低（p<0.05，p<0.01），但ko補(bǔ)陽組效果差于wt補(bǔ)陽組（p

16、<0.01）。見表2。4.2  補(bǔ)陽還五湯對(duì)模型小鼠pi3k、akt、pten蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，ko模型組較wt模型組小鼠pi3k、akt蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），pten蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）;與ko比較，wt變化更顯著（p<0.05，p<0.01）;與wt模型組比較，wt補(bǔ)陽組各蛋白表達(dá)變化更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），而ko補(bǔ)陽組調(diào)控程度不及wt補(bǔ)陽組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。見圖1圖6。4.3  補(bǔ)陽還五湯對(duì)模型小鼠pi3k、akt、pten m

17、rna表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，ko模型組與wt模型組pi3k、akt mrna表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），與ko比較，wt變化更顯著（p<0.05，p<0.01）。wt補(bǔ)陽組與wt模型組比較，各指標(biāo)表達(dá)的變化更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），而ko補(bǔ)陽組調(diào)控程度不及wt補(bǔ)陽組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），與蛋白表達(dá)相似。見圖7。5  討論補(bǔ)陽還五湯由王清任所創(chuàng)，常用于治療缺血性中風(fēng)氣虛血瘀之證。王氏認(rèn)為元?dú)獠赜谏眢w“氣管之內(nèi)，分布周身，左右各得一半”，中風(fēng)后半身不遂是因元?dú)馓潛p，則“經(jīng)絡(luò)自然空虛，有空虛之隙，難免其氣向一邊

18、歸并”，若元?dú)庵皇Ｏ挛宄?，致元?dú)鈿w于半身而致對(duì)側(cè)半身不遂。因此治療上需補(bǔ)充虧損半身的五成元?dú)?。所謂“補(bǔ)陽”即補(bǔ)氣，氣為陽，“還五”即恢復(fù)半身虧損的元?dú)?，由此可保證全身元?dú)馐?，恢?fù)偏癱肢體。王氏指出“元?dú)饧忍摚夭荒苓_(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”，氣虛血行不利，必導(dǎo)致血瘀。本方重用黃芪為君藥，以大補(bǔ)元?dú)?配以當(dāng)歸尾活血和血，為臣藥;紅花、桃仁、川芎、赤芍助當(dāng)歸活血祛瘀，地龍長(zhǎng)于行散走竄，通經(jīng)活絡(luò)，均為佐藥。諸藥合用，使氣旺促血行，活血而不傷正，則筋肉得養(yǎng)，痿廢可愈。課題組前期研究表明，補(bǔ)陽還五湯能在腦缺血后通過降低炎癥反應(yīng)12、抑制細(xì)胞凋亡13、促進(jìn)血管新生4、減少細(xì)胞自噬14等途徑發(fā)揮抗腦

19、缺血損傷作用。pi3k/akt通路是細(xì)胞一條關(guān)鍵的信號(hào)通路，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡的各個(gè)過程5。腦缺血后機(jī)體受到刺激會(huì)釋放各類酪氨酸激酶活性受體激活的物質(zhì)，這些受體能特異性活化pi3k，當(dāng)pi3k激活后，會(huì)將pip2轉(zhuǎn)化成pip3，激活akt。akt作為一種重要的信息分子，不僅能繼續(xù)激活下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mtor）信號(hào)因子及b淋巴細(xì)胞瘤-2基因（bcl-2）、bcl-2相關(guān)x蛋白（bax）等調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、自噬與凋亡15，還能通過減少腫瘤壞死因子-和白細(xì)胞介素-1的釋放減輕腦缺血后炎癥損傷16。而pten能逆轉(zhuǎn)pip2向pip3的轉(zhuǎn)化，起到對(duì)整個(gè)通路的負(fù)性調(diào)控作用17。另有研

20、究表明，pi3k/akt信號(hào)通路還能在腦缺血后通過誘導(dǎo)神經(jīng)再生18、抑制氧化應(yīng)激19、促進(jìn)血管新生20等方式，在腦缺血后恢復(fù)中扮演重要角色。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦缺血后小鼠pi3k、akt的蛋白及mrna表達(dá)上升，pten的蛋白及mrna表達(dá)被抑制，但整體活化程度有限，無法完全修復(fù)受損神經(jīng)，仍有明顯神經(jīng)功能缺損。補(bǔ)陽還五湯的干預(yù)使相關(guān)蛋白調(diào)控作用更明顯，并能顯著改善神經(jīng)功能。我們推測(cè)補(bǔ)陽還五湯可能通過調(diào)控pi3k/akt通路，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。小窩是一種特殊形式的脂筏，位于細(xì)胞膜表面的特異性凹陷區(qū)，在神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞膜上有豐富的表達(dá)。cav-1是小窩中重要的功能結(jié)構(gòu)與核心蛋白，通過“腳手架結(jié)構(gòu)區(qū)

21、”可與下游各類效應(yīng)因子結(jié)合，廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等病理生理過程21。課題組前期發(fā)現(xiàn)，cav-1是治療中風(fēng)的潛在靶點(diǎn)：正常腦內(nèi)有少量cav-1表達(dá)，腦缺血后cav-1迅速增加，cav-1-/-小鼠腦梗死面積縮小速度明顯低于正常小鼠，神經(jīng)功能恢復(fù)也明顯減緩22;cav-1敲除可降低缺血腦組織血管新生4及神經(jīng)干細(xì)胞的增殖23。有研究表明，pi3k/akt通路存在于小窩中并受到cav-1的調(diào)控，抑制cav-1可呈量效關(guān)系減弱akt的活化24。也有研究表明，cav-1能阻斷pi3k/akt通路來抑制胰腺癌的生長(zhǎng)，并且cav-1還可通過抑制神經(jīng)酰胺的釋放25，激活akt信號(hào)通路，阻止細(xì)胞凋亡。據(jù)此

22、，我們推測(cè)cav-1可能通過調(diào)控pi3k/akt通路發(fā)揮抗腦缺血的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯能改善腦缺血后的神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與調(diào)控pi3k/akt通路有關(guān)。同時(shí)ko與wt比較，小鼠腦缺血后神經(jīng)功能評(píng)分改善較低，pi3k/akt通路相關(guān)因子表達(dá)受損，提示補(bǔ)陽還五湯可能是通過cav-1調(diào)控pi3k/akt信號(hào)通路的活性，促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)。綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可能通過cav-1調(diào)控pi3k/akt信號(hào)通路的活性發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，但目前尚無法確定其作用機(jī)制與pi3k/akt信號(hào)通路上調(diào)相關(guān)。今后課題組將采取cav-1基因敲除及pi3k/akt抑制劑雙重阻斷cav1/pi3k/ak

23、t信號(hào)通路的方式，希望進(jìn)一步明確補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血損傷的作用機(jī)制。參考文獻(xiàn)：1 benjamin e， blaha m， chiuve s， et al. heart disease and stroke statistics-2017 update：a report from the american heart associationj. circulation，2017，131（4）：e29.2 黃素芬，周勝?gòu)?qiáng)，羅東，等.陷窩蛋白-1對(duì)永久性大腦中動(dòng)脈閉塞小鼠缺血皮質(zhì)白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-6表達(dá)的影響j.國(guó)際腦血管病雜志，2016，24（11）：1022-1027.3 周勝?gòu)?qiáng).補(bǔ)陽

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