Megazyme-破損淀粉試劑盒說明書

1、簡介：小麥磨粉引起小麥粉中一定比例淀粉顆粒的物理損壞。淀粉損傷程度直接影響吸水和面團混合性能，因而具有重要的技術(shù)意義。此外，受損的顆粒迅速水合并被-和-淀粉酶被水解產(chǎn)生可發(fā)酵的糖。在傳統(tǒng)長期發(fā)酵過程的后期，當(dāng)面粉中的天然糖被酵母發(fā)酵完后，破損淀粉酶解產(chǎn)生的麥芽糖進一步提供發(fā)酵底物。當(dāng)這種傳統(tǒng)可發(fā)酵糖缺乏時，出現(xiàn)產(chǎn)氣不足，所生產(chǎn)的面包體積小硬度大。用于測量破損淀粉的方法大致可分為四大類，提取法（“藍值”），染料染色法，近紅外法和酶消化法。酶消化法通常在這些方法中優(yōu)先選擇。酶消化法利用-淀粉酶，-淀粉酶或這些酶的組合。谷物和真菌-淀粉酶制劑已被用作粗麥芽提取或粗發(fā)酵液。傳統(tǒng)上一直使用的非特異性還原

2、糖法測定水解程度，如鐵氰化鉀滴定法，或與二硝基水楊酸（DNS）反應(yīng)法來測定。原理： 在本方法中，利用真菌-淀粉酶小心地處理使受損的淀粉顆粒經(jīng)水合和水解成麥芽糖加和-極限糊精。真菌-淀粉酶處理的目的是使受損的淀粉顆粒完全溶解而完好顆粒分解極少。通過加稀硫酸終止反應(yīng)，試樣經(jīng)過量的純化淀粉葡糖苷酶處理，而使淀粉衍生的糊精完全降解為葡萄糖。用高純度葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑混合物進行測定葡萄糖含量。測定值表示為淀粉（損壞）占面粉原樣重量的百分比。 精度： 我們實驗內(nèi)通常能得到±3的標(biāo)準(zhǔn)誤。實驗室間測試的匯總于這本小冊子的7-8頁。試劑盒：Megazyme 公司的試劑盒可測試淀粉破損值200

3、次。試劑盒包括測試方法和以下內(nèi)容：瓶1：真菌-淀粉酶（10mL，pH6.0和40時分析Ceralpha試劑是1000U/mL）硫酸銨溶液。4可存放3年以上。瓶2：淀粉葡糖苷酶（4mL，pH4.5和40時分析可溶性淀粉是200 U / mL的可溶性淀粉在pH4.5和40）。硫酸銨溶液。 4可存放3年以上。瓶3：GOPOD試劑緩沖液。緩沖液（48mL，pH值7.4），對羥基苯甲酸和疊氮化鈉（0.4w/v）。4可存放3年以上。瓶4：GOPOD試劑酶。葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和4 - 氨基安替比。凍干粉。-20下可存放5年以上。瓶5：用0.2（w/v）苯甲酸配制的D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5mL，1.5mg

4、/mL）。室溫下可存放5年以上。瓶6：小麥粉標(biāo)準(zhǔn)樣。顯示小瓶標(biāo)簽上顯示有淀粉破損度。在室溫下可存放5年以上。試劑配制：1. 在取用之前使瓶1試劑完全重新懸浮。用100mM的醋酸鈉緩沖液（pH5.0，含5mM的氯化鈣）把一份1mL的試劑稀釋到20mL。用聚丙烯管分裝后貯存于-20，在低溫下使用。-20下可保存3年以上。2. 用100mM的醋酸鈉（試劑1）把一份1mL的瓶2的試劑稀釋至10mL。-20下可保存3年以上。用蒸餾水把瓶3的試劑（GOPOD 試劑緩沖液）稀釋至1L（溶液3）?，F(xiàn)配現(xiàn)用。注： 1，如果該濃縮緩沖液保存在-20下，將形成鹽結(jié)晶，當(dāng)用蒸餾水稀釋至1L時必須完全溶解。 2，該濃縮

5、緩沖液含有0.4（w/v）疊氮鈉。這是一種有毒的化學(xué)品，注意安全。4，瓶4中的試劑溶解在20毫升溶液3中，把其定量轉(zhuǎn)移至裝有剩余溶液3的瓶子中。用鋁箔紙包裹密閉的瓶子避光保存。這是葡萄糖測定試劑（GOPOD試劑）。在2-5可存放3個月或在-20可存放12個月。 如果此試劑是凍結(jié)下保存，最好把它分裝。冷凍/解凍不要超過一次。新鮮配制試劑時可能是淺黃色或淺粉紅顏色。4存放2-3個月后色澤將加深為深粉紅色。用蒸餾水做對照時，此溶液的吸光度應(yīng)小于0.05。試劑（未提供）： 1，含有5mM氯化鈣的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH5.0）。 -向900毫升蒸餾水加入5.7毫升冰醋酸（1.05克/毫升）。用2

6、M氫氧化鈉溶液（8克/ 100毫升）小心地把pH值調(diào)整至5.0。大約需要60毫升。 - 添加0.74g二水氯化鈣氯化鈣并溶解溶解。把提起調(diào)整至1L，緩沖儲存于4。在4可保存6個月以上。2，稀硫酸（0.2v/v） 2.0mL濃硫酸小心地加入到 998mL的蒸餾水中。室溫下可存放2年以上。 設(shè)備（推薦）： 1，玻璃試管（圓底，16x100毫米，12毫升容量）。 2，微型移液器，100微升（如吉爾森Pipetman®或的Rainin EDP-2®電動飲水機）。 3，容積式移液器，例如Eppendorf公司Multipette® - 帶12.5毫升移液管（吸取真菌1mL的

7、-淀粉酶溶液）。 - 帶5.0毫升移液管（吸取0.1mL的緩沖液中的淀粉葡萄糖苷酶溶液）。 - 帶50毫升移液管。（移取8.0mL的稀硫酸和4.0mL的GOPOD試劑）。 4，臺式離心機（轉(zhuǎn)速需要3000rpm，即約1000g）?？蛇x（見注）。 5，分析天平。 6波長510nm分光光度計。 7，渦旋混合器。 8，40的恒溫水浴。 9，秒表。注意事項： 1，用真菌-淀粉酶孵育面粉的時間必須小心控制（即10.0分鐘）。 - 淀粉葡萄糖苷酶孵育的時間并不關(guān)鍵，但至少應(yīng)10分鐘。 - GOPOD試劑孵育的時間不關(guān)鍵，但至少應(yīng)20分鐘。所形成的帶色復(fù)合物在40下進行至少穩(wěn)定2小時。2，在測定步驟4中，真

8、菌-淀粉酶溶液就必須立即劇烈地攪拌試管以防止面粉結(jié)塊。 3，在測定步驟5中，樣品必須轉(zhuǎn)移到試管底部，以確保所有樣品都能與過量的淀粉葡糖苷酶混合。4，每次測定，都需要兩份試劑空白和150mg的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣。 - 空白試劑由0.2mL醋酸緩沖液+4.0mL的葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑。 - 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣由0.1mL醋酸緩沖液 +0.1mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物（150微克/ 0.1毫升）+4.0毫升的葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.2的苯甲酸制備，可在室溫下保存。5，每次測定至少需要一個對照面粉。6，酶制劑不能不能交叉污染注： 1，如果沒有臺式離心機，加稀硫酸后的懸浮液可以通過Wha

9、tman1號濾紙或Whatman GF/ A玻璃纖維濾紙過濾，。 2，建議使用圓底玻璃試管。使用錐底試管會出現(xiàn)混合不均和樣品的結(jié)塊。使用聚碳酸酯試管，可能出現(xiàn)溫度不均衡問題。 3，在測定步驟4中，一些樣品粘附到試管壁。這不影響測定的準(zhǔn)確度。 4，建議在低溫使用GOPOD試劑，這將增加試劑的使用壽命 5，當(dāng)多個樣品同時分析時，使用多功能移液器能顯著減少測試時間。這些移液器也會提高測定的重現(xiàn)性和便利性。 6，淀粉破損率高的樣品在510 nm處的吸光度可能超過的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物的范圍。 如果出現(xiàn)這種情況，從檢測步驟4中取一份溶液用水適當(dāng)?shù)叵♂?，從步驟5重新測定。檢測程序： 1，準(zhǔn)確稱取小麥粉或粉碎的糊化

10、淀粉樣品100±10毫克于厚壁玻璃離心管（16 x 120毫米，12毫升的容量）。 2含有樣品的試管于40預(yù)平衡約5分鐘。 3把真菌-淀粉酶溶液（50單位/毫升）裝在小玻璃燒杯40預(yù)平衡約5分鐘。4，每支試管中加入1.0毫升的預(yù)平衡的真菌-淀粉酶溶液（50單位/毫升），每管，在旋渦混合器攪拌約5秒。在40下精確孵育10分鐘（從添加酶開始計時）5，加真菌-淀粉酶剛好10分鐘后，向每支試管中加稀硫酸溶液（0.2體積/體積）8.0毫升，劇烈攪拌約5秒。使酶失活而終止反應(yīng)。 6試管以3000rpm（1000g）離心5分鐘或用Whatman1號（9cm）濾紙過濾懸液。 7，小心精確地把0.1mL上清溶液（或濾液）轉(zhuǎn)移到兩支試管底部。 8，每支試管中加0.1毫升的淀粉葡萄糖苷酶溶液（2U），旋渦混合器攪拌，40孵育10分鐘。9，每支試管中加4.0mL的GOPOD試劑溶液，以每管（包括葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物和試劑空白管），試管40下孵育20分鐘。 10，以試劑空白做參照，在510nm處測量所有溶液的吸光度。