細(xì)胞實(shí)驗(yàn) MTT

1、 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 利用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞群體的相對(duì)細(xì)胞數(shù)量 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.熟悉掌握細(xì)胞傳代培養(yǎng)2.學(xué)習(xí)和掌握細(xì)胞生長(zhǎng)速率的測(cè)定3.學(xué)會(huì)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況4.了解MTT法在生物學(xué)研究中的應(yīng)用二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是觀測(cè)細(xì)胞在一代生長(zhǎng)期內(nèi)增殖過(guò)程的重要指標(biāo)，為培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)參數(shù)之一。 圖一：體外培養(yǎng)細(xì)胞的一代生長(zhǎng)曲線MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語(yǔ)化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。MTT比色法

2、，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)(OD值在0.7以內(nèi))，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)?！咀ⅰ縈TT比色法的影響因素1.溶劑溶解甲瓚能力不同；2.培養(yǎng)基中的酚紅、血清和PH變化可能影響OD值；

3、3.DMSO溶解能力強(qiáng)，但是可能與殘留MTT發(fā)生反應(yīng)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)不斷加深。（改良方案：SDS+DMSO）；三、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺(tái)，CO2 培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡2.實(shí)驗(yàn)材料：HeLa細(xì)胞，96孔板3.實(shí)驗(yàn)試劑：PBS(Ph=7.4)，MTT母液(5mg/mL,溶于PBS)，裂解液（10%SDS-0.01N HCL于室溫保存），胰酶，DMEM培養(yǎng)基，血清四、實(shí)驗(yàn)步驟1.取生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，用胰酶消化計(jì)數(shù)，配制細(xì)胞懸液濃度為8×104/mL；2.每列都加完全培養(yǎng)基100L（除去第二列），取細(xì)胞懸液200L接種到第二列，在第二列取100L接種到第三列，依次類推；最終的細(xì)胞濃

4、度見(jiàn)下表；3.檢測(cè)：棄去舊培養(yǎng)基，加入100L含MTT的培養(yǎng)基（5mg/mL MTT:培養(yǎng)基=1:10）；4.孵育4hr，然后加100L裂解液過(guò)夜；5.用酶標(biāo)儀測(cè)OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm；表一：96孔板設(shè)計(jì)（溶液為200L）123456A無(wú)細(xì)胞細(xì)胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋B無(wú)細(xì)胞細(xì)胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋C無(wú)細(xì)胞細(xì)胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋D無(wú)細(xì)胞細(xì)胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋E無(wú)細(xì)胞細(xì)胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋F無(wú)細(xì)胞細(xì)胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋G無(wú)細(xì)胞細(xì)胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋H無(wú)細(xì)胞細(xì)

5、胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋【注】第7至11列與第2至6列相同，第12列與第1列相同；五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表二：實(shí)驗(yàn)組1 OD值結(jié)果123456A-0.0940.1130.0470.2410.033-0.030B-0.0960.1660.0240.3190.1740.111C-0.0870.2880.0250.3060.1920.096D-0.0970.4590.4070.3440.1830.143E-0.0740.5310.0570.3430.1840.163F-0.0740.3860.0000.3960.1910.126G-0.0920.3410.0470.2890.1

6、27-0.015H-0.0500.0300.0310.2980.162-0.138平均值-0.0830.2890.0800.3170.1560.057表三：實(shí)驗(yàn)組2OD值結(jié)果789101112A0.1660.114-0.0270.056-0.059-0.063B0.3280.7950.0200.018-0.0060.057C0.7190.3360.0210.0550.0020.044D-0.0750.4210.0780.0650.0130.038E0.5350.9480.3010.0320.024-0.046F0.7940.1200.062-0.026-0.025-0.016G0.1260.1

7、280.002-0.060-0.042-0.035H0.358-0.044-0.041-0.072-0.049-0.648平均值0.3690.3520.0520.009-0.018-0.083/倍稀釋圖一：實(shí)驗(yàn)組1的OD平均值曲線圖/倍稀釋圖二：實(shí)驗(yàn)組2的OD平均值曲線圖結(jié)果分析：1、 由圖一可以得出我們小組的實(shí)驗(yàn)組1的結(jié)果并不理想；實(shí)驗(yàn)最后測(cè)得OD值沒(méi)有規(guī)律，較亂；而且在未加入裂解液之前，在顯微鏡下觀察時(shí)，并沒(méi)有松針，而且細(xì)胞有可能被污染；分析原因應(yīng)該是在接種細(xì)胞的時(shí)候細(xì)胞沒(méi)有混勻?qū)е掠械牡胤郊?xì)胞過(guò)于密集而死亡；也有可能是在加藥或者接種的時(shí)候被污染；2、由圖二可以看出實(shí)驗(yàn)組2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想；隨著接種細(xì)胞濃度的降低，OD值也在減少；細(xì)胞密度偏大測(cè)出的吸光度也會(huì)偏大，細(xì)胞密度小吸光度也會(huì)偏小；另外跟細(xì)胞狀態(tài)也有關(guān)系，細(xì)胞狀態(tài)不好的話，吸光度值也會(huì)低的；六、實(shí)驗(yàn)思考題可以通過(guò)哪些措施保證接種細(xì)胞時(shí)均勻分布？1、 因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過(guò)程中要反復(fù)多次混勻，如每加8個(gè)孔就混 勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同；加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差；2、 吹打時(shí)懸液總量不能太多，達(dá)到吸管吸液量的3到4倍，比較容易混勻；吸液量過(guò)多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過(guò)少，吹打的力度就不夠，吹打就會(huì)