細(xì)胞工程第3mdf

1、體外單倍體誘導(dǎo)與單倍體育種體外單倍體誘導(dǎo)與單倍體育種第第13章章 主要內(nèi)容：?jiǎn)伪扼w的體外誘導(dǎo)方法和單倍體育種技術(shù)； 重點(diǎn)：花藥和花粉的培養(yǎng)方法 難點(diǎn)：小孢子母細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程；體外單倍體誘導(dǎo)體外單倍體誘導(dǎo) 利用離體培養(yǎng)花藥或小孢子來(lái)誘導(dǎo)形成單倍體植株?；ǚ壑仓甑男螒B(tài)發(fā)生方式 （1）愈傷組織型 花粉粒愈傷組織單倍體植株 （2）胚狀體型 花粉粒胚狀體單倍體植株 （3）混合型 花粉粒愈傷組織單倍體植株 花粉粒胚狀體單倍體植株單倍體育種(haploid breeding) 單倍體植物，經(jīng)過(guò)人工染色體加倍，形成純和二倍體，從二倍體中篩選優(yōu)良個(gè)體，繁育成新品種；或者利用優(yōu)良的純和二倍體作為雜交育種的原始材料

2、。單倍體育種的優(yōu)點(diǎn) 便于控制雜種分離，縮短育種周期； 利于排除顯隱性基因干擾，提高選擇效率； 利于加快自交系選育； （通過(guò)多代自花授粉或多代近交后所得到的純系） 易于作為誘變育種的材料； （用物理、化學(xué)因素誘導(dǎo)動(dòng)植物的遺傳特性發(fā)生變異，再?gòu)淖儺惾后w中選擇符合人們某種要求的單株/個(gè)體，進(jìn)而培育成新的品種或種質(zhì)的育種方法 ）主要內(nèi)容 13.1 植物小孢子的發(fā)育植物小孢子的發(fā)育 13.2 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng) 13.3 花藥和花粉培養(yǎng)方法花藥和花粉培養(yǎng)方法 13.4 單倍體育種在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用單倍體育種在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用13.1 植物小孢子的發(fā)育植物小孢子的發(fā)育 小孢子發(fā)育過(guò)程： 高等植物

3、初生造孢細(xì)胞多次有絲分裂 小孢子母細(xì)胞(體積大、核大、質(zhì)濃、無(wú)液泡) 減數(shù)分裂開(kāi)始，纖維素初生壁溶解，形成胼胝質(zhì)壁 連續(xù)兩次分裂，DNA量由4c下降為1c，染色體數(shù)由2n變成n。小孢子母細(xì)胞發(fā)育到成熟的花粉粒的過(guò)程 分為三個(gè)時(shí)期 第1期，小孢子母細(xì)形成四分體（四分體期） 小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂厚的胼胝質(zhì)包裹的小孢子四分體胼胝質(zhì)分解,四個(gè)小孢子分離。第2期、分離的單個(gè)小孢子發(fā)育(單核期) 單核早期、中期 起初為薄壁球形小孢子，細(xì)胞核大而圓居細(xì)胞中央； 單核晚期(單核靠邊期)：細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)液泡，并逐漸變大，細(xì)胞核被擠到一邊，細(xì)胞變?yōu)榧忓N形。 A型花粉粒，第2期末，細(xì)胞明顯增大，花粉細(xì)胞第1次有絲分裂(

4、不均等分裂) 。小孢子細(xì)胞壁外表不斷沉積孢子花粉素，構(gòu)成堅(jiān)韌外壁，外壁內(nèi)是纖維素構(gòu)成的內(nèi)壁。第3期，小孢子發(fā)育為花粉粒(雙核期或三核期) 第3期，進(jìn)入標(biāo)志為小孢子細(xì)胞中出現(xiàn)明顯雙核。 核于近壁處分裂，近壁的核小為生殖細(xì)胞核(配子體)；中央核為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞核。 到一定階段，生殖細(xì)胞進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的液泡分散消失。不同時(shí)期，生殖核第2次有絲分裂為兩個(gè)雄配子，可成為成熟的兩細(xì)胞花粉和三細(xì)胞花粉。資料 約有70%的被子植物當(dāng)花粉成熟時(shí)只有營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞，如棉、桃、梨、柑橘、茶、大蔥、大豆、百合等，此時(shí)稱(chēng)為二核期花粉粒。 另外一些植物的花粉在散出之前，其生殖細(xì)胞再進(jìn)行一次有絲分裂，產(chǎn)生2個(gè)精

5、細(xì)胞，它們是以含有1個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和2個(gè)精細(xì)胞進(jìn)行傳粉的，被稱(chēng)為三核期花粉粒，如玉米、水稻、油菜、小麥、向日葵等。二核期花粉粒和三核期花粉粒通常又被稱(chēng)為雄配子體，精子則稱(chēng)為雄配子。 13.2 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng) 13.2.1 花藥培養(yǎng) 13.2.2 花粉培養(yǎng) 13.2.3 小孢子母細(xì)胞培養(yǎng)花藥培養(yǎng) anther culture，將成熟或未成熟的花藥從母體植株上取下，放在無(wú)菌的條件下，使其進(jìn)一步生長(zhǎng)、發(fā)育成單倍體細(xì)胞或植株的技術(shù)。 13.2.1 花藥培養(yǎng) 花藥培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：不需要游離花粉處理，比花粉培養(yǎng)方便快捷。為單倍體培養(yǎng)的主要手段。 缺點(diǎn)：需要對(duì)后代進(jìn)一步篩選。因?yàn)榭赡艿玫交ㄋ?/p>

6、體細(xì)胞來(lái)源的二倍體植株。 花藥培養(yǎng)基常用類(lèi)型： 瓊脂固體培養(yǎng)， 液體培養(yǎng)， 固液雙層培養(yǎng)。獲得花藥再生單倍體植株的兩種方式 器官再生：花粉先形成愈傷組織，分化形成植株；如小麥，水稻等。 胚狀體再生：花粉先形成胚狀體，發(fā)育成植株。如煙草等。 胚狀體發(fā)生途徑優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等。 胚狀體再生的兩個(gè)特點(diǎn)： 兩極性，胚狀體發(fā)生起初，即具有根端和芽端； 具有完整植株的特點(diǎn)，與外植體維管束無(wú)直接聯(lián)系。13.2.2 花粉培養(yǎng) 花粉培養(yǎng)(pollen culture)：指把花粉從花藥中分離出來(lái)，以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。1，裸子植物的花粉培養(yǎng) 研究現(xiàn)狀：研究較少，難度較小

7、。 花粉培養(yǎng)的典型樹(shù)種：麻黃、銀杏、紫杉、榧等。 裸子植物花粉培養(yǎng)的愈傷組織特點(diǎn)：常為無(wú)色愈傷組織，可連續(xù)繼代培養(yǎng)，有少量含葉綠體；常為不對(duì)稱(chēng)細(xì)胞分裂，其中較小細(xì)胞重復(fù)分裂，常出現(xiàn)染色體多倍化和其他染色體畸變。 裸子植物花粉獲取方法：取小孢子囊或幼小球果75酒精消毒1min0.5漂白粉浸泡5 min無(wú)菌水沖洗，無(wú)菌濾紙吸干剖開(kāi)孢子囊置于無(wú)菌容器，4干燥器貯存花粉散落后，收集花粉。2，被子植物的花粉培養(yǎng) 研究現(xiàn)狀：研究較多，離體培養(yǎng)難度較大。 被子植物成熟花粉離體培養(yǎng)常用方法：懸滴、看護(hù)或植板培養(yǎng)法等。Kameya等(1970)懸滴培養(yǎng)法 成熟花粉粒獲得與培養(yǎng)：取甘藍(lán)幼嫩花蕾，消毒后無(wú)菌濾紙包裹

8、，待花藥開(kāi)裂散出成熟花粉粒，收集懸浮于液體培養(yǎng)基，花粉粒5080粒/懸滴。4接種(防花粉破裂)，20暗培養(yǎng)，至形成細(xì)胞團(tuán)。 培養(yǎng)基：改良Nitsch培養(yǎng)基，附加酵母提取物和椰乳，蔗糖濃度1015。Sharp等(1972)看護(hù)培養(yǎng)法花粉粒獲得與培養(yǎng)：取1cm長(zhǎng)番茄花蕾，消毒后劃破花藥取出花粉，制成每ml含20?；ǚ鄣膽腋∫骸?看護(hù)培養(yǎng)：瓊脂培養(yǎng)基上放消毒番茄花藥，花藥上放濾紙，濾紙上滴0.5ml懸浮液。 培養(yǎng)條件：25和光照。約28d，濾紙上長(zhǎng)出綠色薄壁細(xì)胞組成的細(xì)胞群落。 培養(yǎng)基：White無(wú)機(jī)鹽、MS鐵鹽、泛酸鈣0.1mgL、煙酸5.0mgL、鹽酸硫胺素4.0mgL、鹽酸吡哆醇1.0mgL、

9、肌醇100mgL、2,4-D6.0mgL、蔗糖4、瓊脂0.8。水稻和煙草花粉采用植板培養(yǎng)法 等量花粉懸浮液和瓊脂培養(yǎng)基(45)混合，倒入平培養(yǎng)皿冷卻，25下培養(yǎng)。 逐漸可形成細(xì)胞團(tuán)，然后繼續(xù)分化為球形胚或愈傷組織。13.2.3 小孢子母細(xì)胞培養(yǎng) 應(yīng)用：研究減數(shù)分裂和花粉發(fā)育。為單倍體育種和誘變育種提供材料。 1967年Ito和Stern培養(yǎng)無(wú)瓣延齡草和麝香百合的小孢子母細(xì)胞獲得成功，得到四分體小孢子。 研究方法： 取材：取長(zhǎng)1224mm麝香百合花蕾75酒精浸泡消毒1min 剝開(kāi)花蕾取出花藥，切開(kāi)花藥一端輕壓使小孢子母細(xì)胞從切口處擠出(帶狀細(xì)胞團(tuán)即為減數(shù)分裂前期的小孢子母細(xì)胞)。 培養(yǎng)：Whit

10、e液體培養(yǎng)基，20靜置培養(yǎng)715d，分化出四分體小孢子細(xì)胞。變溫處理 Nitsch等采用變溫處理方法改變小孢子母細(xì)胞的發(fā)育途徑，并誘導(dǎo)出胚狀體。 研究方法：曼陀羅或煙草植株20轉(zhuǎn)入3和5，各處理23d煙草花芽在處理后，培養(yǎng)37d，約有12花粉粒具有均等核。 而未經(jīng)處理的花粉粒在同樣條件下培養(yǎng)只有約5均等核。一種有效的油菜小孢子分離系統(tǒng) 油菜花苞表面消毒 含蔗糖13液體培養(yǎng)基中研磨均質(zhì)化 離心收集釋放出來(lái)的小孢子 相同培養(yǎng)基洗滌和培養(yǎng)。13.3 花藥與花粉的培養(yǎng)方法 13.3.1 材料選擇 13.3.2 材料預(yù)處理 13.3.3 培養(yǎng)基 13.3.4 接種與再生植株的培養(yǎng)13.3.1 材料選擇

11、3.1.1供體材料的遺傳差異 花藥培養(yǎng)成敗的決定性影響因素：母本材料遺傳背景。 不同物種間差異以及不同品種間的差異 如，茄科曼陀羅屬、煙草屬和禾本科的水稻容易誘導(dǎo)；但其屬內(nèi)種間或品種間也有明顯差異性。 雜種優(yōu)勢(shì)：一般雜種比純種容易誘導(dǎo)花藥培養(yǎng)。 如，三葉橡膠、小麥等雜種一代的花粉愈傷組織誘導(dǎo)率，遠(yuǎn)超其親本花粉誘導(dǎo)率。 花藥培養(yǎng)力(即愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率、胚狀體誘導(dǎo)率、植株誘導(dǎo)率等)是受多基因控制的數(shù)量性狀，隨基因型差異而變化較大。2。母本生理狀態(tài)的影響花粉培養(yǎng)力高的母本材料： 雙子葉植物的早期花蕾花藥中花粉。 健壯母本花粉。 母本氮素營(yíng)養(yǎng)處于饑餓狀態(tài)。 高緯度、高海拔地區(qū)栽培小麥花藥；春播的

12、冬小麥比秋播花粉植株誘導(dǎo)率高。 田間栽培比溫室栽培更有利于花粉誘導(dǎo)。 環(huán)境因素：花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期的光周期、溫度、營(yíng)養(yǎng)狀況。3?；ǚ郯l(fā)育時(shí)期 被子植物花粉發(fā)育的三個(gè)階段： 第一期：四分體時(shí)期； 第二期：?jiǎn)魏似?小孢子階段)； 此期又分為單核早期，中期(中央期)和晚期(單核靠邊期) 第三期：雙核期和三核期(雄配子體階段)3。花粉發(fā)育時(shí)期 花粉誘導(dǎo)的關(guān)鍵時(shí)期：?jiǎn)魏丝窟吰?單核晚期)。多數(shù)植物，較易培養(yǎng)成功時(shí)期為單核期花粉(包括早、中、晚期) 。 選材方法：對(duì)于有限數(shù)目花藥植物，需根據(jù)花蕾大小不同，找出小孢子發(fā)育時(shí)期不同的花藥(因花蕾形態(tài)與花粉發(fā)育時(shí)期間有對(duì)應(yīng)關(guān)系)。 例，煙草花蕾花冠花萼長(zhǎng)度、

13、水稻穎花發(fā)育、小麥拔節(jié)、棉花現(xiàn)蕾、花生開(kāi)花等現(xiàn)象。13.3.2 材料預(yù)處理 常用方法： 1、低溫處理 2、高溫處理 3、離心處理 4、激光照射 5、乙烯利處理 6、甘露醇處理1、低溫處理： 能明顯提高花粉胚的誘導(dǎo)率。 不同材料采用的低溫處理溫度和時(shí)間具有差異性： 煙草花藥79下處理714d。水稻花藥1O處理2h至14d。小麥、黑麥、楊屬花藥13處理220d，如高于5預(yù)處理，花粉將沿正常途徑發(fā)育而越過(guò)誘導(dǎo)敏感期，不利于誘導(dǎo)。百合、大豆、大麥4處理48h。石刁柏6處理6d。低溫處理提高花粉誘導(dǎo)率的作用機(jī)制 存在兩種觀點(diǎn)。 Nitsch等(1973)認(rèn)為，低溫可變花粉粒第1次有絲分裂紡錘體的取向，使

14、花粉粒的極性分化不起作用，形成兩個(gè)均等細(xì)胞，使花粉朝著形成胚胎的方向發(fā)育。 Sunderland等(1978)提出，低溫處理有絲分裂時(shí)的或剛完成有絲分裂的花粉效果比處理單核期小孢子更加明顯。因此認(rèn)為低溫作用是保持花粉的活力，在此期間營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞得以完成細(xì)胞質(zhì)改組轉(zhuǎn)向脫分化胚胎發(fā)生。2、高溫處理 蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)：較高溫度(32)處理3d后，再于25正常培養(yǎng)，可大幅提高花粉胚得率。 Liu(劉公社1995)實(shí)驗(yàn)表明，游離小孢子的高溫預(yù)培養(yǎng)敏感期：培養(yǎng)最初2448h。而在正常培養(yǎng)48h后，再給予高溫則不發(fā)生作用。3、離心處理 Tanaka等(1973)將單核后期煙草花粉,在轉(zhuǎn)速1011kr/m

15、in離心30min，產(chǎn)生花粉小植株的頻率從30.5提高到38.2，每個(gè)花藥產(chǎn)生的小植株的數(shù)目從1.6株提高到5.4株。 楊一平等(1980)對(duì)楊樹(shù)花藥接種前，2kr/min離心20min，對(duì)花粉啟動(dòng)有良好效果。 離心對(duì)花粉誘導(dǎo)的作用機(jī)理：仍不清楚，可能是花粉孤立化，給花粉啟動(dòng)創(chuàng)造了條件；也可能因?yàn)殡x心改變了花粉軸向，使花粉均等分裂(離心對(duì)雙核期花粉無(wú)效)。4、激光照射 ：陳震古等(1999)對(duì)黑楊派、白楊派、青楊派等18種楊樹(shù)離體花藥用He-Ne20(Jcm-2)激光照射，表明激光能促進(jìn)花粉愈傷組織的芽分化。5、乙烯利處理 ：Bennett等(1972)發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂前用乙烯利(2-氯乙基磷酸)

16、噴施小麥植株，能促使花粉細(xì)胞核分裂，將這些花藥放于培養(yǎng)基培養(yǎng)可得到8個(gè)核花粉。王敬駒等(1974)用4g/L乙烯利處理水稻植株有促進(jìn)花粉愈傷組織形成的作用。6、甘露醇處理 衛(wèi)志明等(1993)首先提出，甘露醇預(yù)培養(yǎng)對(duì)小麥游離小孢子培養(yǎng)有促進(jìn)作用。用0.3mol/L甘露醇處理小麥游離小孢子5d，移入培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)出花粉植株。對(duì)照用蔗糖培養(yǎng)基處理，沒(méi)有花粉胚形成；且甘露醇和蔗糖混合液處理小孢子也不能形成花粉胚。13.3.3 培養(yǎng)基 1、基本培養(yǎng)基：不同組成對(duì)花藥培養(yǎng)有明顯影響，但不同研究結(jié)論不一致。 常用花粉培養(yǎng)基本培養(yǎng)基：MS(較廣泛采用，常被改良)、Nitsch、B5、BN、BH、MB、N6

17、(禾本科)、H(楊屬)、Miller等。 馬鈴薯培養(yǎng)基，有利小麥、水稻花粉愈傷組織誘導(dǎo)，但誘導(dǎo)分化頻率很低。 成分：20馬鈴薯汁、鐵鹽(同MS培養(yǎng)基)、2mg/L2,4-D、0.5mg/L激動(dòng)素、9%蔗糖。在培養(yǎng)水稻花粉時(shí)蔗糖濃度降低為35。 改進(jìn)的馬鈴薯培養(yǎng)基：加入了一定量的無(wú)機(jī)鹽，可用于小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)和分化。(1)碳源 最常用碳源：蔗糖，常用210。 例，煙草和水稻花粉愈傷組織形成和分化的蔗糖適宜濃度是25；馬鈴薯、油菜、小麥、小黑麥、大麥的花藥則為612。玉米花粉愈傷組織產(chǎn)生需要1215，甘蔗花藥培養(yǎng)基中可高達(dá)20。 蔗糖的作用：碳源；滲透調(diào)節(jié)劑；誘導(dǎo)花粉植株。 一般，較高濃度蔗糖

18、有利于提高花粉愈傷組織誘導(dǎo)效率，同時(shí)抑制花藥體細(xì)胞增殖。 其他碳源： Hunter發(fā)現(xiàn)在大麥、粳稻、小麥花藥培養(yǎng)中麥芽糖比蔗糖更為有效。 朱至清等(1990)提出，用葡萄糖替代蔗糖可以大幅度提高冬小麥花藥產(chǎn)生花粉胚的頻率。(2)激素 花藥培養(yǎng)的不同階段，所用激素的種類(lèi)和濃度不同。而不同植物種類(lèi)，激素種類(lèi)和濃度的選擇差異很大。 I.脫分化培養(yǎng)基：需細(xì)胞分裂素(低)和生長(zhǎng)素(高)共同作用。 生長(zhǎng)素類(lèi)：2,4-D、IAA、IBA、NAA等。 細(xì)胞分裂素類(lèi)：KT、6-BA等。 濃度范圍:O.16.0mgL II.分化培養(yǎng)基：細(xì)胞分裂素為主要誘導(dǎo)激素，可配合使用生長(zhǎng)素或其他激素。 例，陳正華等(1979

19、)橡膠花粉培養(yǎng)中添加0.5mg/LGA3；吳蝴蝶等(1994)培養(yǎng)基中添加O.20.5mg/LABA。 III. 誘導(dǎo)生根：生長(zhǎng)素類(lèi)單獨(dú)或配合使用，濃度0.0253.0mg/L。(3)附加成分 有益花粉愈傷組織生長(zhǎng)的有機(jī)附加物： 水解酪蛋白或水解乳蛋白(300500m/L)、酵母提取物(5001000mgL)、肌醇(100mgL)、谷氨酰胺(500800mgL)等。 抗氧化劑：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、維生素C等，阻止褐化。 吸附物質(zhì)：活性炭，利于促進(jìn)花粉植株的產(chǎn)生。2、條件培養(yǎng)基 條件培養(yǎng)基(condition culture medium)：利用組織培養(yǎng)物產(chǎn)生分泌物進(jìn)入培養(yǎng)基，使得培養(yǎng)基條

20、件化，成為條件培養(yǎng)基。經(jīng)條件化的培養(yǎng)基可促使培養(yǎng)細(xì)胞分裂和分化。 許智宏等(1981)報(bào)道的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)： 雙核早期的大麥花藥接種到馬鈴薯或N6液體培養(yǎng)基(含1.5mgL 2,4-D和0.5mgL激動(dòng)素)上培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后取出花藥，離心去除散落的花粉和細(xì)胞碎片，得到條件化液體培養(yǎng)基。 然后將單核中期花藥接種到條件培養(yǎng)基，8090大麥花藥形成愈傷組織，而對(duì)照液體培養(yǎng)基上僅5花藥有反應(yīng)。13.3.4 接種與再生植株的培育 1、材料的滅菌處理 1)510漂白粉水溶液上清液浸泡1015min； 或者 810安替福民(次氯酸鈉溶液)浸泡510min； 或者 0.1升汞浸泡10min。 2)無(wú)菌水沖洗3

21、5次。 3)超凈工作臺(tái)上取出花藥接種。 接種密度要適當(dāng)大，以發(fā)揮集體效應(yīng)。2、培養(yǎng)條件 溫度：一般較高溫度有利于愈傷組織形成，適宜溫度為2830。 光照：不同植物對(duì)光照的反應(yīng)不一，常弱光培養(yǎng)。光照長(zhǎng)短、光照強(qiáng)度和光質(zhì)對(duì)花粉誘導(dǎo)研究很少。3、花粉植株的培育 花粉植株(pollen plant)誘導(dǎo)產(chǎn)生的兩條途徑： 花粉胚(pollen embryo)產(chǎn)生小植株： 植株性狀：直接從花藥囊中長(zhǎng)出，莖葉細(xì)弱，根系不發(fā)達(dá)，不能直接移植到土壤，需分苗移栽。 培育煉苗：小苗單棵或數(shù)棵，無(wú)菌條件移栽到不含激素T培養(yǎng)基(或MS)，待小苗長(zhǎng)出45片真葉和一些根后移栽到花盆或苗床上。 移栽后，遮蔭防曬，保持土壤和空

22、氣濕度?；ǚ塾鷤M織(pollen callus)產(chǎn)生小植株 培育過(guò)程： 愈傷組織生長(zhǎng)1520d轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，越不利于分化)。 分化培養(yǎng)基上，1020d可看到芽分化。 生根培養(yǎng)基上，芽基部長(zhǎng)出不定根。 待根系生長(zhǎng)到一定程度后移栽。 移栽后管理的一般措施： 移栽初期，保持較高的土壤和空氣濕度，光照不宜過(guò)強(qiáng)。而對(duì)于溫度則差異加大。 隨著幼苗的生長(zhǎng)，逐漸改變培養(yǎng)條件，使之適應(yīng)自然的栽培狀況。4、花粉植株的鑒定 原因：存在體細(xì)胞干擾和生殖細(xì)胞自發(fā)加倍現(xiàn)象。 鑒定方法： 形態(tài)鑒定：依據(jù)單倍體植株外貌特征(瘦弱、葉片窄小、花小珠頭長(zhǎng))、結(jié)實(shí)性特點(diǎn)(開(kāi)花但不結(jié)實(shí))、花粉粒著色和大小(花粉敗育、不著色、花粉粒小于正常二倍體)、氣孔大小數(shù)目(倍性越高，氣孔越大、氣孔密度越小)； 細(xì)胞學(xué)鑒定：根尖有絲分裂中期染色體數(shù)目和染色體行為； 雜交鑒定法：根據(jù)后代分離的比例對(duì)再生株進(jìn)行鑒定； 分子標(biāo)記鑒定：利用同工酶譜分析、RFLP(restriction fragment length polymorphi