作物枯萎病尖孢鐮刀菌拮抗菌株JK-2的篩選和鑒定

1、1. 按文中意見修改后在改，2. 短芽抱桿菌3. 要有枯萎病抑制圖，4. 要有測序圖5. 取消dna圖6. 不耍用20%三醴酗作物枯萎病尖胞鐮刀菌拮抗菌株jk-2的篩選和鑒定葛慈斌",郝曉娟x,黃素芳i,朱育菁i,鄭雪芳i,劉波"(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所生物農(nóng)藥研究中心，福州350003;2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州31 0029 )摘要：從福建省永泰、福淸、閩侯等6個(gè)縣(市)采集作物根際土壤，篩選出芽抱桿菌58株。采用目標(biāo)病原菌多垂菌株 平行測定法，試驗(yàn)初篩出的芽抱桿菌對(duì)6株枯萎病尖他鐮刀菌的抑制作用，篩選得到拮抗菌株3株，其中1株(定名為 jk2)的

2、抑菌效果特別顯著。對(duì)jk2的抑菌譜調(diào)查表明,該菌株對(duì)大麗輪枝菌(verti ci ilium dahliae')黑白輪枝菌(verti ci ilium albo-atrum)s 真菌輪枝得(verti ci ilium fungicola 鱷梨根腐病原菌(verliciuium fheobromae)、青枯雷爾氏菌(rais t onia solanacearum)和禽致病性人腸桿菌(escherichia coli)都具冇較強(qiáng)的抑制作用。對(duì)jk-2進(jìn)行菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及 生理生化試驗(yàn)，再結(jié)合16s rdna序列測定及sherlock mis脂肪酸分析，判定該菌株為fel芽他桿

3、菌(brevibacillus brevis) o 將jk-2培養(yǎng)液澆灌移栽后1天的西瓜苗，試驗(yàn)其川間防治西瓜枯萎病的效果，1個(gè)月后，防效可達(dá)78.26%。關(guān)鍵詞：生防菌；尖抱鐮刀菌；短芽砲桿菌；sherlock mis脂肪酸分析 中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ascreening and identification of biocontrol bacteria strain jk-2against plant pathogenic fungus, fusarium oxysporum schl.liu bo1, ge ci-bin1, zhu yu-jing1, zheng xue-fang1,

4、 hao xiao-juan1,2, huang su-fang1(1 biocide center, institute of biotcchonology, fa as, fuzhou 350003, china;2.1nstitute of biotechonology, university of zhejiang, hanzhou 310027, china)abstract: fifty-eight strains of bacillus spp. were isolated from the rhizosphere soils, which were collected from

5、 yongtai, fuqing, minhou and other 3 counties in fujian province. using multiple target pathogens inhibiting test with 6 strains of fusarium oxysporum schl., three strains of biocontrol bacteria were screened to show high inhibition against f. oxysporum among these strains, one strain, which was nam

6、ed with jk-2, was the most effective jk-2 had strong antagonistic effect on a broad spectium of pathogenic fungi and bacteria, such as verticillium dahliae, verticillium alho-atruin, verticillium fimicola, verticillium theohromae, rai st onia solanacearum and escherichia coli. based on the observati

7、ons on its morphological features and culture characters, a series of physiological and biochemical experiments, sherlock mis analysis and its 16s rdna sequence phylogenetic relation, jk-2 was identified as brevihacillus brevis. the bioassay in field indicated that jk-2 reduced watermelon fusarium w

8、ilt severity by 78.26% one month after inoculating jk-2 into the rhizospheres of watermelons, which were planted one day before基金項(xiàng)比 國家863計(jì)劃項(xiàng)hl(2002aa24403l-2)o作者簡介：葛慈斌，通訊作者：劉波(1957-),男，博士，研究員，從事生物技術(shù)和生物防治研究，e-mail：laeptb pub3.fz.fj .cnkey words: biocontrol bacterium; fusarium oxysporum schl.; breviba

9、cillus brevis; sherlock mis analysis植物真菌性枯萎病是由鐮刀菌屬真菌寄牛引起的一種土傳病害，其中尖砲鐮刀菌（fizrdm oxysporum schl.）是主要的病原菌種類之一?？菸∫话憧蓪?dǎo)致作物減產(chǎn)20%-30%,嚴(yán)重田塊可達(dá) 50%-80%,其至絕產(chǎn)，成為限制我國農(nóng)作物生產(chǎn)發(fā)展的重要因素?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用對(duì)枯萎病的防治具 有一定的效果，但這會(huì)帶來農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染及病原菌抗藥性等問題。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)尋求拮 抗菌防治枯萎病菌給了普遍關(guān)注，并且在枯萎病發(fā)生區(qū)域的土壤生態(tài)系統(tǒng)中，篩選到一些具有較好生防 前景的有益微生物本研究從西瓜、臥豆等作物根際土壤分離

10、芽砲桿菌，試驗(yàn)英對(duì)枯萎病菌的拈抗 作用；并對(duì)篩選出的具有顯著拮抗作用的菌株jk-2進(jìn)行了形態(tài)、培養(yǎng)特征、牛理牛化等性狀的鑒定和16s 1dna丿芋列測定及sherlock mis脂肪酸分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料與方法1. 1供試病原菌西瓜、黃瓜、甜瓜、me豆、花生和辣椒枯萎病尖砲鐮刀菌（fusarium oxysporum schl.）菌株、番茄 青枯雷爾氏菌ralstonia solanacearum）菌株由本研究中心保存;大麗輪枝菌（verticillium dahliae 11938 菌株、黑白輪枝菌 verticillium albo-atrum） 12230 菌株、真菌輪枝霉（v

11、erticillium fungicola ） 2352 菌 株和鱷梨根腐病原菌（verticillium theobromae ） 2202 |w株購自徳國微生物保存中心（dmsz）；禽致病 性大腸桿菌（escherichia coli） k88菌株由福建省農(nóng)科院畜牧?xí)t(yī)研究所饋贈(zèng)。1.2培養(yǎng)基病原真菌川馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)皋（pda）培養(yǎng)；番茄靑枯病原菌川蔗糖蛋口豚瓊脂培養(yǎng)基（spa） 培養(yǎng)；芽砲桿菌和大腸桿菌的平板培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白月東（na）培養(yǎng)基；芽抱桿菌的搖瓶培養(yǎng)采用bpy 培養(yǎng)基（蛋白腺1.0%,牛肉浸膏0.5%,酵母浸出物0.3%,葡萄糖0.5%, nacl 0.5%, ph7

12、.0-7.2）。1.3 土樣采集與芽孑包桿菌的分離純化從福建省永泰、福清、閩侯等6個(gè)縣（市）的西瓜、玉葫、乳豆等作物根際采集土壤樣本120份， 風(fēng)干、研磨后，取土樣10g,加入盛有90ml無菌水的250ml的三角瓶中，振蕩30min,使土樣均勻分布 成土壤懸液。取lml 土壤懸液，梯度稀釋后涂布na平板；于30°c下培養(yǎng)72h后，挑取單菌落，涂片鏡 檢；選取芽孑包桿菌轉(zhuǎn)入斜血培養(yǎng)基上保存，作為待測菌株。1.4尖孑包鐮刀菌拮抗菌株的篩選拮抗菌株的篩選采用抑菌圈測定法。將待測菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，30°c、200r/min, 72h。取尖抱鐮刀 菌砲子懸液0.5ml,加入到熔化并冷

13、卻至45°c左右的7ml 0.7%的pda培養(yǎng)基內(nèi)，混勻，傾覆在預(yù)先已 凝固的pda平板上。凝固后，在平板上放置t津杯，向牛津杯內(nèi)加入待測菌株培養(yǎng)液200ul,以無菌水 為對(duì)照；26°c培養(yǎng)48h后，測量待測菌株在接種鐮刀菌的pda平板上形成的抑菌圈直徑。1.5拮抗菌株對(duì)不同病原菌的拮抗性能測定采用1.4的方法，試驗(yàn)篩選出的拮抗菌株（jk-2）對(duì)大麗輪枝菌、黑白輪枝菌、真菌輪枝需、鱷梨 根腐病原菌和番茄青枯雷爾氏菌、禽致病性大腸桿菌的抑制作用。1.6拮抗菌株的鑒定1.6. 1培養(yǎng)特征和形態(tài)特征：接種jk-2于na培養(yǎng)基平板，3（）°c培養(yǎng)72h后，觀察菌落顏色和形

14、態(tài)， 顯微鏡觀察菌體的形態(tài)特征。1.6.2生理生化特征：參照東秀珠等的方法進(jìn)行。1.6.3分子生物學(xué)（16s rdna）鑒定：搖瓶培養(yǎng)jk-2,收集茵體，用酚-氯仿法抽提基因組dna。以 基因組 dna 為模板,采用引物 pf （ + ） : 5'ggttaagtcccgcaacgagcgc-3'和 pr （-） : 5,-aggaggtgatccaaccgca-3, （山上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）進(jìn)行16s rdna-pcr擴(kuò)增。25ul反應(yīng)液中包含ix pcrbuffer, 50ng dna, immdntp, 0.4mm 引物，1.5 單位 taq 酶。pcr

15、 擴(kuò)增條件為:94°c 5 分鐘;94°c 30秒，55°c 30秒，72°c 30秒，25個(gè)循環(huán)；72°c 7分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，川1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測 pcr擴(kuò)增結(jié)果，用promega公司的wizard pcr產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化，冋收目的片段。 1=1的片段的dna序列在寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測定。將測序結(jié)果通過因特網(wǎng)檢索genbank （http： //biast/）,采用blast軟件進(jìn)行序列同源性比較，確定菌株的分類地位。1.6.4 sherlock mis鑒定：參照

16、劉志輝等的方法進(jìn)行。用tsb瓊脂培養(yǎng)基（bd公司,貨號(hào)81125）培 養(yǎng)拮抗菌株，收集菌體，經(jīng)皂化、卬基化處理后，萃取出卬基脂肪酸，用氣相色譜儀（女捷倫6890,檢 測器fid）分析甲基脂肪酸的成分，把分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中儲(chǔ)存的參考菌種的脂肪酸信息進(jìn)行比対。1.7拮抗菌株防治西瓜枯萎病的田間小區(qū)試驗(yàn)試驗(yàn)在福建永泰進(jìn)行。選擇往年枯萎病發(fā)牛較為嚴(yán)重的rn塊，供試西瓜品種為“早春紅玉”，灌艮法處理移栽后id的西瓜苗。jk2培養(yǎng)液（40億活芽泡/ml）的畝施用量為2000ml,稀釋100倍;對(duì)照 藥劑20%三ii坐酗口j濕性粉劑（江蘇劍牌農(nóng)藥化丁何限公司）由施用量420g,稀釋600倍；以淸水為空 白對(duì)

17、照。每處理3個(gè)重復(fù),每重復(fù)（小區(qū)）面積66n?（約100株）,隨機(jī)排列。于處理后30d進(jìn)行調(diào)査, 各小區(qū)隨機(jī)抽取西瓜苗約30株，統(tǒng)計(jì)發(fā)病株數(shù)，計(jì)算發(fā)病率和防治效果。發(fā)病率和防治效果的計(jì)算方 法為：發(fā)病率（）=病株數(shù)/調(diào)査株數(shù)x100,防治效果（）=（對(duì)照發(fā)病率處理發(fā)病率）/對(duì)照發(fā)病率 xlooo2結(jié)果與分析2. 1尖胞鐮刀菌拮抗菌株的篩選從na平板上選擇性地挑出外觀有明顯差別的細(xì)菌菌落，涂片鏡檢，獲得58個(gè)芽砲桿菌菌株；通 過抑菌圈測定法，篩選出對(duì)供試的6株尖砲鐮刀菌都具有一定抑制作川的芽砲桿菌3株；其屮的1株， 定名為jk2,對(duì)尖淪鐮刀菌的抑制作用特別強(qiáng)，抑菌圈直徑都在15.0mm以上，而u

18、抑制效果穩(wěn)沱。 jk-2對(duì)西瓜、黃瓜、甜瓜、豆豆、花牛和辣椒枯萎病尖他鐮刀菌的抑制作用列表出來，附圖進(jìn)行分析2.2 jk-2對(duì)其它病原菌的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果見表k jk-2對(duì)不同的病原真菌、病原細(xì)菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作川，但對(duì)不同病原菌的 抑制作用強(qiáng)度存在差異。jk2對(duì)4種植物病原真菌：黑口輪枝菌、大麗輪枝菌、真菌輪枝霉和鱷梨根腐 病原菌的抑菌圈育徑分別為21.9、1&7、18.2和16.6mm,對(duì)黑口輪枝菌的抑制作用茲強(qiáng)。jk2對(duì)番茄 青枯雷爾氏菌和禽致病性大腸桿菌的抑制作用也較強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為14.7和16.3mm。表1、jk2對(duì)不同病原菌的抑制作用tabic 1 inhibit

19、ion of strain jk-2 against different strains of pathogenic fungi or bacteria病原菌菌株抑筒圈直徑（mm）strains of pathogenic fungi or bacteriadiameter of the inhibited ring (mm)verticiilium theobromae 2202 菌株16.6真菌輪枝零(verticillium fungicola ) 2352 菌株18.2大麗輪枝菌(merticillium dahliae) 11938 菌株i&7黑白輪枝菌(verticilli

20、um albo-atrum) 12230 菌株21.9首枯雷爾氏菌(ralstonia solanacearum) f. 1.3-010702-01 -v 菌株14.7大腸桿菌(escherichia coli) k88 菌株16.32.3 jk-2的培養(yǎng)、形態(tài)和生理生化特征jk-2在na培養(yǎng)基上，菌落無光澤，不透明，淺黃色，表而濕潤。革蘭氏染色陽性，營養(yǎng)體細(xì)胞桿狀，單牛鞭毛；有芽抱，芽抱近橢圓形，中牛，不膨大。（附上照片）對(duì)jk-2的生理生化特征的鑒定結(jié)果為：v. p試驗(yàn)、甲基紅反應(yīng)呈陰性，接觸酶反應(yīng)和氧化酶反應(yīng)呈 陽性；對(duì)炭源的利用表現(xiàn)為能利用葡萄糖、h翻糖，但不能利用木糖和l-阿拉們糖，

21、也不能水解淀粉； 可以利用檸檬酸鹽和硝酸鹽，并且可以使明膠液化，但不能分解酪素；在含有7%naci的培養(yǎng)基上不能 生長。（附上表格）2.4 16s rdna序列分析結(jié)果以jk-2的基因組dna為模板，利川引物pf、pr進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到一條約為450bp的dna片 段（圖1 ）；回收該片段，并進(jìn)行序列測定，jk-2的16srdna長度為427bp。將jk-2的!6srdna序列 與gcnbank數(shù)據(jù)庫中已有的細(xì)閑16s rdna序列進(jìn)行blast比較，結(jié)果表明jk-2與短芽他桿菌 （brevibcicillus brevis）同源性達(dá)99.4%。（附上序列,說明同原性）m 1 23 ck30

22、00 w500 400該圖可以刪 圖1: jk-2等3個(gè)菌株的16s rdna-pcr擴(kuò)增電泳圖 注：2： jk-2, m： marker, ck：空白對(duì)照 fig 1: 16s rdna-pcr result of three bacteria strains note: 2: jk-2, m: dna mark2.5脂肪酸sherlock mis的鑒定結(jié)果菌株jk-2的全細(xì)胞脂肪酸氣相色譜圖見圖2。將jk-2脂肪酸成份分析結(jié)果與midi數(shù)據(jù)庫比對(duì)， 發(fā)現(xiàn)jk2與短芽他桿菌的匹配度最高，相關(guān)指數(shù)為0.802o根據(jù)jk2的生理生化反應(yīng)試驗(yàn)、16s rdna 序列分析和sherlock mis鑒

23、定的結(jié)果，判定該菌株為短芽飽桿菌。pa1817.51716.5 圖2：菌株jk2的全細(xì)胞脂肪酸氣相色譜圖注：圖中橫坐標(biāo)表示色譜分析時(shí)間（min）,縱坐標(biāo)表示色譜峰高值fig. 2 result of gas chromatography analysis on cellular fatty acid of strain jk2 note: abscissa: times of gas chromatography analysis; ordinate: values of the peaks2. 6 jk2對(duì)西瓜枯萎病的防治效果試驗(yàn)結(jié)果見表2。在處理30d后，淸水對(duì)照區(qū)的發(fā)病率高達(dá)45.56%

24、；拈抗菌株jk2培養(yǎng)液處理組 西瓜苗的發(fā)病率為9.89%,防治效果達(dá)7&26%,打20%二哩酮可濕性粉劑防治效果(82.93%)間的差 異不顯箸(pvo.ol)。(20%-卅酮可濕性粉劑防治效果取消)，表2 jk-2培養(yǎng)液對(duì)西瓜枯萎病的防治效果table 2 biocontrol efficacy of j k-2 against watermelon fusarium wilt in the field處理treatments調(diào)查株數(shù)（株）no. of the investigatedwatermelons病株（株）no. of the wiltedwatermelons發(fā)病率（）r

25、ates of the wiltedwatermelon防治效果（%）biocontrol efficacyjk-2培養(yǎng)液9199.8978.26a三啤酮9077.7882.93a清水對(duì)照(ck)904145.56*在同一欄內(nèi)，帶相同字母的數(shù)字在duncaifs新復(fù)極差測驗(yàn)的多重比較p<0.0l時(shí)沒有差異note: means within a column followed by the same letter are not significantly different （pvo.ol） according to waller-duncan multiple range test3

26、討論芽泡桿菌(bacillus spp.)是自然界廣泛存在的一類細(xì)菌，其生理特征豐富多樣，分布極廣泛，是土 壤和植物根際的重要微生物種群。-些菌株可以產(chǎn)生桿菌肽、大環(huán)脂、環(huán)脂和類噬菌體顆粒等十幾種抗 菌物質(zhì)，在植物病害生物防治中被廣泛應(yīng)用?？捉ǖ葓?bào)道了枯草芽砲桿菌b-903對(duì)棉枯萎病等多種土傳 鐮刀菌和蘋果輪紋病等具有抑菌活性，并通過試驗(yàn)證明用b-903菌液浸種可顯著降低棉炭疽病等棉苗病 害和菠菜枯萎病，防效分別可達(dá)51.7%-69.4%和6&1%76.2%何。晏立英等從油菜根際或葉圍分離得到的 枯草芽砲桿菌y1菌株，對(duì)油菜菌核病菌菌絲的牛長具有明顯的抑制作用；在溫室盆栽試驗(yàn)和田間小區(qū)

27、試 驗(yàn)屮，該菌株對(duì)油菜菌核病的防效達(dá)到92%l,jo此外，芽孑包桿菌能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孑包，這佇利于生防 菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖。本研究從土壤中篩選得到的jk-2菌株，不僅對(duì)西瓜、2e豆和辣椒等作物的枯萎病菌具有較強(qiáng)的抑制 作用，而且對(duì)大麗輪枝菌、真菌輪枝霉等其它植物病原真菌及青枯雷爾氏菌和禽致病性大腸桿菌的抑制 作川也較強(qiáng)，說明該菌株的抑菌譜廣，具有被開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力；經(jīng)鑒定，該菌株為短芽砲桿菌。 短芽砲桿菌是具有廣譜抗菌活性的一種生防菌，該菌能以活體形式寄居到大量的真菌植物病原體屮，包 括灰色葡萄抱，蒼耳單絲殼菌及終極腐霉；該菌可以通過分泌抗菌代謝物短桿菌肽s

28、(gramicidin s)和 種生物表而活性劑來抑制真菌或細(xì)菌的生長。另外，短芽抱桿菌分泌蛋白能力強(qiáng)，而且胞外蛋白酶 活性低，具有分泌衣達(dá)外源蛋白的天然優(yōu)勢，可用于建立高效的原核分泌衣達(dá)系統(tǒng)1,3-14j;伍曉林籌報(bào)道 短芽砲桿菌對(duì)原油中高碳鏈的飽和烷桂具有降解作川。目前，在國內(nèi)還較少見到將短芽砲桿菌應(yīng)川于 植病生防方而的報(bào)道。jk-2對(duì)植物枯萎病菌的抑制作用己得到證實(shí)，至于該菌株的抑菌活性物質(zhì)及其在 牛防上的應(yīng)用，則有待于進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)1 劉波,朱育菁,周涵韜，等.農(nóng)作物枯萎病的研究進(jìn)展.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004, 43 (s) ： 47-582 郝曉娟,劉波，謝關(guān)林.植物枯萎病生物防治研究進(jìn)展.中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2005, 21