超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定營養(yǎng)強化食品中維生素B12的含量

1、（自然科學(xué)版）JOURNAL OF SHANGHAI UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE)第 20 卷 第 1 期2014年2月Vol. 20 No. 1Feb. 2014DOI: 10.3969/j.issn.1007-2861.2013.07.016超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定營養(yǎng)強化食品中維生素 B12 的含量馬穎清1,王霞1,張小剛1,羅立強2(1. 上海德諾產(chǎn)品檢測, 上海 200436; 2. 上海大學(xué) 理學(xué)院, 上海 200444)(本刊編委曹衛(wèi)國推薦)摘要:采用固相萃取(solid phase extraction, SPE)柱對樣品中維生素 B12 進(jìn)行濃

2、縮與凈化,提出了一種可靈敏測定營養(yǎng)強化食品中維生素 B12 含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)方法,并通過實驗考察了不同固相萃取柱對維生素 B12 含量測定結(jié)果的影響. 實驗結(jié)果表明, 采用 HLB(hydrophile-lipophile balance number) 固相萃取柱進(jìn)行富集與凈化, 維生素 B12 在0.5100.0 µg/L 濃度范圍內(nèi)與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系, 檢出限為 1.0 µg/kg,

3、說明該方法 具有分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點, 適用于對營養(yǎng)強化食品中維生素B12 含量的測定. 關(guān)鍵詞 : 維生素 B12 ; 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜; 營養(yǎng)強化食品中圖分類號 : TS 207.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼 : A文章編號 : 1007-2861(2014)01-0114-06Determination of VitaminB12in Fortified Foods byUltra High Performance Liquid Chromatography-TandemMass SpectrometryMA Ying-qing1 , WANG Xia1 , ZHANG Xiao

4、-gang1 , LUO Li-qiang2(1. Shanghai Deno Products Testing Service Co., Ltd., Shanghai 200436, China;2. College of Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China)Abstract: A simple, fast and accurate method for determination of vitamin B12 in fortifiedfoods is developed using ultra high perform

5、ance liquid chromatography-tandem mass spec- trometry (UPLC-MS/MS). The sample is concentrated by solid phase extraction (SPE) column. The linear range of the method is from 0.5 to 100.0 µg/L with a correlation co- efficient of 0.999 9. The detection limit is 1.0 µg/kg. The proposed method

6、 exhibits high sensitivity and good reproducibility for determining vitamin B12 .Key words: vitamin B12 ; ultra high performance liquid chromatography-tandem quadrupolemass spectrometry (UPLC-MS/MS); fortified food維生素 B12 , 又稱鈷胺素, 是一種含有 3 價鈷的多環(huán)系化合物, 4 個還原的吡咯環(huán)連在一起成為 1 個咕啉大環(huán)(與卟啉相似). 維生素 B12 是一類含有鈷的咕啉類

7、化合物的總稱, 主要存在于動物性食品中1-2 , 是一種深紅色針狀晶體, 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 在中性溶液中耐熱, 但酸、堿、光、氧收稿日期: 2013-07-05基金項目: 國家自然科學(xué)基金資助項目(61171033)通信作者: 馬穎清(1984), 女, 助理工程師, 研究方向為食品檢測. E-mail: myq 0437163 115第 1 期馬穎清, 等: 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定營養(yǎng)強化食品中維生素 B12 的含量化劑和還原劑均會對其結(jié)構(gòu)造成破壞. 維生素 B12 是維持人體正常造血功能、促進(jìn)機(jī)體生長、保持神經(jīng)系統(tǒng)功能的必需維生素, 對人體健康具有重要作用3 . 人體所需的維生素 B12

8、的量很少, 從醫(yī)學(xué)角度推薦的日補充量為 2.4 µg, 懷孕和哺乳期婦女的日需要量為 2.6 µg, 嬰兒為0.4 µg4 . 補充過量可能會引起過敏反應(yīng), 甚至?xí)?dǎo)致過敏性休克; 攝取不足則可能會引起惡性貧血、骨髓變性、舌炎、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、四肢僵硬、易受刺激、困倦、精神不振等. 人體內(nèi)的 維生素 B12 來源于動物性食物, 如肝、腎、肉類、魚、貝類動物、禽蛋和乳類等, 植物類食物中 不含維生素 B12 . 由于素食主義者日益增多, 為補充人體所需要的維生素 B12 , 有些商家推出 了營養(yǎng)強化食品, 在其中人為添加了來源于動物性食品中的營養(yǎng)物質(zhì)維生素 B12 .

9、目前, 用于測定維生素 B12 含量的方法主要有微生物法5 、光譜法6-7 、電化學(xué)方法8-11 和 高效液相色譜法12-17 , 其中微生物法操作比較繁瑣, 費時費力且不夠精確; 光譜法穩(wěn)定性 較差; 電化學(xué)方法靈敏度較低; 現(xiàn)有的高效液相色譜法, 僅適用于測定維生素 B12 含量較高 的預(yù)混料, 且測定時間較長. 為了快速、精確地測定營養(yǎng)強化食品如強化大米中維生素 B12 的含量, 本研究利用固相萃取 (solid phase extraction, SPE) 柱對樣品進(jìn)行濃縮與凈化, 采 用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (ultra high performance liquid chrom

10、atography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS) 法對維生素 B12 的含量進(jìn)行測定. 本方法中的 SPE 柱價格較 低, 采用 UPLC-MS/MS 方法檢測時間較短、簡單快捷, 測定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好.1實驗部分1.1 試劑和材料乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純, 無水乙酸鈉為分析純, 購自國藥集團(tuán); 實驗用水為去離子水, 本實驗室自制.維生素 B12 標(biāo)準(zhǔn)品(純度為 98%)購自德國 Dr. Ehrenstorfer 公司; C18 和 HLB(hydrophile- lipophile balance number) 固相萃取柱 (均為 500

11、mg, 6 mL)購自 Waters 公司.1.2 儀器設(shè)備超 高 效 液 相 色 譜-串 聯(lián) 質(zhì) 譜 聯(lián) 用 儀(ACQUITY UPLC/Xevo TQ 質(zhì) 譜 分 析 系 統(tǒng)), 購 自 Waters 公司; 分析天平購自 Mettler 公司; 高速冷凍離心機(jī)購自 Thermo Fisher 公司; 漩渦振 蕩器購自 Talboys 公司; DSY- 氮吹儀購自北京東方精華苑科技; Millipore 超純水 系統(tǒng)購自美國 Millipore 公司.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制儲 備 液 的 配 制: 準(zhǔn) 確 稱 取 適 量 的 標(biāo) 準(zhǔn) 品 置 于 容 量 瓶 中, 用 50% 甲 醇 水 溶

12、 液 配 制 成0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液, 于 4 C 冰箱中保存.標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制: 準(zhǔn)確量取適量儲備液, 以乙腈-水(體積比為 19)為溶劑逐級稀釋, 得 到一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液.1.4 樣品制備準(zhǔn)確稱取 2 g(精確至 0.000 1 g)營養(yǎng)強化大米樣品, 置于 50 mL 燒杯中, 加適量溫水溶 解、攪拌. 轉(zhuǎn)移至 50 mL 容量瓶中, 加入 25 mL 0.1 mol/L 的乙酸鈉溶液(pH=4.5), 于 40 C 水浴中超聲 30 min. 取出冷卻至室溫, 加水定容至刻度, 搖勻. 將樣品轉(zhuǎn)移至 50 mL 離心管 中, 5 000 r/min 離心 5 min. 準(zhǔn)

13、確移取 15 mL 上清液作為樣品提取液, 通過 HLB 固相萃取小 柱(HLB 固相萃取小柱預(yù)先用 5 mL 甲醇加 5 mL 水活化), 待樣品溶液完全流出后, 加 5 mL5% 甲醇水溶液淋洗固相萃取柱. 棄去流出液, 再用 5 mL 甲醇洗脫小柱, 收集洗脫液, 于 50 C氮氣吹干. 最后, 用 5 mL 乙腈-水(體積比為 19) 溶液溶解, 過 0.22 µm 有機(jī)相濾膜至樣品瓶（自然科學(xué)版）116第 20 卷中, 待分析.1.5 色譜條件和質(zhì)譜條件色譜柱為 Waters BEH C18(100.0 mm×2.1 mm× 1.7 mm); 流動相 A

14、 為 0.1% 甲酸水溶液, 流動相 B 為乙腈, 二者的梯度洗脫條件如表 1 所示; 流速為 0.3 mL/min, 進(jìn)樣體積為 5 µL,柱溫為 40 C.表 1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phases時間/min流動相 A/%流動相 B/%01.003.003.904.005.00909010109090101090901010離 子 源 為 電 噴 霧 離 子 源,掃 描 方 式 為 正 離 子 模 式,檢 測 方 式 為 多 反 應(yīng) 監(jiān) 測(multiplereaction monitori

15、ng, MRM); 電 噴 霧 電 壓 為 1.0 kV, 離 子 源 溫 度 為 150 C, 脫 溶 劑 流 量 為800 L/h. 定性和定量離子對、對應(yīng)的錐孔電壓以及碰撞能量如表 2 所示.表 2測定維生素 B12 的質(zhì)譜參數(shù)Table 2Mass spectrometry parameters for detecting vitamin B12定性離子對 m/z定量離子對 m/z錐孔電壓/V碰撞能量/eV保留時間/min678.8/146.9678.8/359.1678.8/457.0678.8/146.9265030362.422結(jié)果與討論2.1 提取液的選擇維生素 B12 易溶于

16、水、甲醇和乙醇, 水溶液呈中性.已有研究發(fā)現(xiàn), 維生素 B12 在 pH 值為 4.55.0 的弱酸條件下最穩(wěn)定, 在強酸(pH<2.0)或堿性溶液中易分解, 遇強光或紫外線易被破壞, 遇熱會受到一定程度的破壞15 . 本研究分別選擇水、0.1 mol/L 乙酸鈉溶液(pH=4.5)和甲醇作為提取液進(jìn)行實驗. 實驗結(jié)果表明, 以 0.1 mol/L 乙酸鈉溶液(pH=4.5)作為提取液時,回收率較高, 且重現(xiàn)性好. 因此, 本實驗選擇 0.1 mol/L 乙酸鈉溶液(pH=4.5)作為提取液.2.2 固相萃取柱的選擇維生素 B12 為水溶性維生素, 具有弱極性, 且大米中維生素 B12

17、的含量較低, 基質(zhì)干擾較多, 無法直接進(jìn)行檢測. 本實驗先采用固相萃取法對樣品進(jìn)行濃縮, 選用 Waters C18(500 mg,6 mL) 和 Waters HLB (500 mg, 6 mL) 固相萃取柱對樣品進(jìn)行除雜與富集. 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 選擇 C18 固相萃取柱進(jìn)行濃縮凈化的干擾較大, 回收率低; 而 HLB 固相萃取柱具有較高的吸附容 量, 回收率高. 原因如下: C18 和 HLB 作為兩種常用的固相萃取柱, 二者的保留機(jī)理均為反相, 但 HLB 固相萃取柱的吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合而成的大孔共聚物, 通過一個“特殊的極性捕獲基團(tuán)”來

18、增加極性物質(zhì)的保留量,117第 1 期馬穎清, 等: 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定營養(yǎng)強化食品中維生素 B12 的含量具有良好的水浸潤性. 因此與硅膠相比, HLB 固相萃取柱吸附劑的表面積增大了 23 倍, 容量因子大大提高, 且 30 mg HLB 的吸附容量相當(dāng)于 100 mg C18. 因此, 本實驗選擇 HLB 固相萃取柱(500 mg, 6 mL)對樣品進(jìn)行凈化與濃縮.2.3 線性關(guān)系和檢出限準(zhǔn)確移取適量維生素 B12 儲備液, 用乙腈-水(體積比為 19)稀釋成一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液,濃度分別為 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 50.0, 100.0 µg/L.

19、以標(biāo)準(zhǔn)工作液中被測組分峰面積為縱坐標(biāo), 濃度為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得到回歸方程為 Y =142.995X 8.824 19, 相關(guān)系數(shù) r 為 0.999 9. 當(dāng)維生素 B12 的添加濃度為 1.0 µg/kg 時, 測得的質(zhì)譜峰信噪比大于 10, 說明本方法的定量檢 出限為 1.0 µg/kg. 圖 1 為維生素 B12 的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 其中 Conc 為濃度(µg/L), Residual 為離散程度, Response 為響應(yīng)程度.圖 1維生素 B12 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1Standard curves of vitamin B122.4 準(zhǔn)確度和精

20、密度本實驗選擇營養(yǎng)強化大米固體顆粒作為實際樣品進(jìn)行測定, 平行測定 11 次, 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3.6%. 維生素 B12 標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖如圖 2 所示, 其中縱坐標(biāo)表示響應(yīng)強度, 橫坐標(biāo)表示保 留時間(min). 可以看出, 維生素 B12 在 2.42 min 處出峰, 峰形尖銳. 與高效液相色譜相比, 出 峰時間較早, 縮短了檢測分析時間, 響應(yīng)靈敏.圖 2維生素 B12 標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖Fig. 2Mass spectrum of vitamin B12 standards（自然科學(xué)版）118第 20 卷同樣地, 本研究選擇食用大米作為空白樣品進(jìn)行添加回收實驗, 按照上述實驗方法進(jìn)行處理

21、及測定. 加標(biāo)樣品的質(zhì)譜圖如圖 3 所示, 其中縱坐標(biāo)為響應(yīng)強度, 橫坐標(biāo)為保留時間(min),維生素 B12 的濃度為1.0 µg/kg, 加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果如表 3 所示. 結(jié)果表明, 本方法 在食用大米 10.0100.0 µg/kg 濃度添加范圍內(nèi)的回收率在 80%120% 之間, 說明采用本方法 測定維生素 B12 的含量具有可行性.圖 3 加標(biāo)樣品的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectrum of spiked sample表 3維生素 B12 加標(biāo)回收率及精密度測定結(jié)果Table 3Results of recoveries and precisi

22、ons of vitamin B121測定值/(µg·kg )回收率/%添加濃度/(µg·kg1 )平均回收率/%變異系數(shù)/%12312310501008.07548.130101.6008.96546.57098.45011.7349.0299.0480.7596.26101.6089.6593.1498.45117.3098.0499.0495.995.899.72.01.31.7結(jié) 束 語3本研究采用弱酸性溶液提取樣品, 通過固相萃取法對樣品進(jìn)行凈化與富集, 運用 UPLC-MS/MS 法對營養(yǎng)強化食品中的維生素 B12 含量進(jìn)行測定. 與已有方法

23、相比, 本方法準(zhǔn)確度高、干擾少, 能夠排除液相色譜方法中的雜峰干擾, 具有靈敏、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點.參考文獻(xiàn):1 周芳梅, 蔡雙福, 文燦, 等. 固相萃取-高效液相色譜法測定飲料中維生素 B12 J. 現(xiàn)代食品科技,2010, 26(7): 759-762.119第 1 期馬穎清, 等: 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定營養(yǎng)強化食品中維生素 B12 的含量2 李紅艷, 王瑾, 邵亮亮, 等. 固相萃取-高效液相色譜法測定功能性飲料中微量維生素 B12 J. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012(3): 384-386.3 Guggisberg D, Risse M C, Hadorn R. Determina

24、tion of vitamin B12 in meat products byRP-HPLC after enrichment and purification on an immunoaffinity column J. Meat Science,2012, 90(2): 279-283.4 魯杰, 楊大進(jìn), 王竹天. 固相萃取-高效液相色譜法測定保健食品中維生素 B12 的研究 J. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2004, 16(4): 324-328.5 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 5413.142010 嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12 的測定 S. 北京: 中華人民共和國衛(wèi)生部, 2010

25、.6 李姝. 紫外吸光光度法測定維生素 B12 J. 理化檢驗: 化學(xué)分冊, 2005(1): 53-54.7 Zhou Y K, Li H, Liu Y, et al. Chemiluminescence determination of vitamin B12 by a flow- injection method J. Analytica Chimica Acta, 1991, 243: 127-130.8 向偉, 李將淵, 馬曾燕. 多壁碳納米管修飾金電極測定維生素 B12 J. 化學(xué)研究與應(yīng)用, 2007, 19(6):710-716.9 劉永明, 李桂芝. 維生素 B12 在玻碳電極上的伏安行為及測定 J. 分析化學(xué), 2004, 32(9): 1182-1184. 10 Kuralay F, Vural T, Bayram C, et al. Carbon nanotube-chitosan modified