薄層色譜之薄層板的制備技術(shù)和薄層分析的點(diǎn)樣技術(shù)訓(xùn)練

1、色譜知識(shí)理論之薄層色譜理論基礎(chǔ)、操作及薄層掃描法簡(jiǎn)介藥檢文摘日期:2011-8-11碑層色譜基礎(chǔ)理論、操作及碑層掃描法簡(jiǎn)介一、基木概念及機(jī)理1基本概念：層析法（色譜法）足利用混合物屮各組分（或成分）的現(xiàn)化性質(zhì)的差別，使各組 分以不m程度分布在兩個(gè)不相混溶的相中，由丁各組分的不m速度移動(dòng)，因而達(dá)到分離的過(guò)程及方 法。層析法分為:紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜、液相色譜法等，我們主要討論薄 層色譜法。薄層色譜法（層析法）根裾層析原理分為二大類：吸附®析：利用被分離物質(zhì)在吸附劑上被吸附能力不mj，用洗脫液使組分分離，如硅膠g”氧化 鋁薄層層析。分配層析：利川被分離物質(zhì)在兩相十分配

2、系數(shù)不同使飢分分離。如微晶纖維素層析、紙層析等。2層析機(jī)理:從層析法概念屮我們了解任何層析都關(guān)系到被分離物質(zhì)溶質(zhì)在兩相之叫的分配，即 關(guān)系到分配系數(shù)（k溶質(zhì)在同定相中濃度/浴質(zhì)在流動(dòng)中濃度的大小”只是在不同層析法中”k冇不同 的意義。在吸附層析法中k稱為吸附系數(shù)。kxa/xs”表示在一定溫度卜達(dá)到平衡時(shí)”在單位時(shí)間內(nèi)被吸附劑表而吸附的溶質(zhì)的濃度xa與從吸附 劑表面解吸附到溶劑展開(kāi)劑屮溶質(zhì)濃度xs之比。分配層析法：k為分配系數(shù)，即在一定溫度下達(dá)到平衡吋，溶質(zhì)在固定相中的濃度cs與其在 流動(dòng)中的濃度cm之比。即 kcs/cm二、薄層材料及薄層板的制備1材料： 背材：支持薄層吸附劑的物質(zhì)耍求：有一定

3、的機(jī)械強(qiáng)度；能耐受展開(kāi)劑和兄色劑的化學(xué)作用及腐蝕；能耐受反應(yīng)的溫度；表 面光骨，平整，冇一定的厚度，保證吸附劑厚度均勻，以免引起誤差。儀器掃描用板要求一定的板 厚以便薄層斑點(diǎn)在儀器光束的焦距上（如cs930”要求厚度在15mm左右。常見(jiàn)背材足玻璃板，一般使用的是鏡而玻璃；在涂鋪薄層板前，將玻璃劃裁成長(zhǎng)寬為 10xl0n10xl5,20xl0h20x20cm的玻璃板11磨邊之后”用洗液或洗滌劑浸泡、洗凈、晾干，表謝不應(yīng)冇 指紋、汕跡、水跡，否則影響吸附劑的牢固度及定性定景的準(zhǔn)確性。 吸附劑：利用薄層層析解決一個(gè)分析任務(wù)，主要在于選擇好合適吸附劑與展開(kāi)劑。常用吸附劑簡(jiǎn)介：按文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，在円常工作中硅

4、膠g使用率在50、硅膠10、纖維素9、氣化 鋁3、聚酰胺25。下面對(duì)使用率高的兒個(gè)吸附劑進(jìn)行討論。硅膠：縮小硅膠"整個(gè)結(jié)構(gòu)中含有許多硅醇基-si-oh”硅膠的吸附性主要在干此基w，基上羥® 與極性化合物或不飽合化合物形成氯鍵，產(chǎn)生吸附力。氧化鋁由于制備方法和處理方法不同，氧化鋁可分為屮性、堿性和酸性氧化鋁。氧化鋁的吸附力主要依靠其氧原子與被測(cè)物屮活潑氫結(jié)合成羥基而產(chǎn)生的。另外其暴露的a13 與芳香環(huán)上ji電子作用形成a雜的絡(luò)合物”也是產(chǎn)生吸附的因素。聚酰胺：常用柯四種，聚酰胺6、66、11、乙酰化聚酰胺、吸附力由w內(nèi)部存在的酰胺鍵與被分離組分中的酚、酸、醌及硝基化合物形成氫

5、鍵而產(chǎn)生的。纖維素：常用有天然纖維素、微晶纖維素等。其結(jié)構(gòu)是含人置p-1、4葡萄糖甙鍵合的纖維二糖"分子屮人量的羥基使w具親水性，在鋪板屮 帶入水分被纖維素吸附變成為分配薄層中的固定相。2薄s板的制備：耍求薄層板各部位的厚度均勻一致，表面平整，無(wú)劃痕，少氣泡，牢固性好。制板：將吸附劑涂鋪在一定背材上，使成厚度均勻一致的溥層的過(guò)程。方法：分干法、濕法。一般常川濕法。濕法鋪板程序：將吸附劑用一定比例的水溶液成者是含粘合劑的水溶液調(diào)勻成糊狀，r;用手工 或機(jī)器將吸附劑均勻涂布薄層背材上（厚度一般在025-055mm之間置水平臺(tái)上，自然陰干，吸附 層析板在使用前置1o5'c活化1小時(shí)

6、后置干燥器中備用。乎工制板時(shí)使用刮板器將調(diào)勻的吸附劑通過(guò)03mm或05mm狹縫刮鋪在背材上、刮鋪力度耍均 勻，-般制出薄層板較佳。機(jī)器鋪板的原理同手工制板，只足刮鋪的速度較均勻（由機(jī)器控制）故 制備的薄層板質(zhì)量較穩(wěn)定。另外還冇傾注鋪板法、浸漬法、噴霧法等。薄層板制備中注意m題。 含煅石膏作粘合劑的吸附劑在加水或含cmc的水溶液調(diào)勻后，在2分鐘內(nèi)鋪板"以免粘合劑 固化而使鋪板固難。 補(bǔ)板時(shí)防止板而有氣泡的方法是調(diào)勻吸附劑時(shí)玻棒順一個(gè)方m攪動(dòng)，再者在調(diào)勻時(shí)滴加少許 乙醇。 鋪板時(shí)不吸附劑一般情況下，與溶液之比例為1:3"活化110°c30分鐘。 關(guān)于活化i'k

7、l題，活化就是將吸附劑水分加熱去棹的過(guò)程，其目的就是增加吸附劑的吸附能力， 增加活度。 關(guān)于活度問(wèn)題：薄層活化是將吸附劑屮水解吸附的過(guò)程，但吸附劑與水的結(jié)合（氫鍵）是可 逆的。判定吸附能力人小的標(biāo)志足活度，活度一般分五級(jí)，測(cè)定過(guò)程足將兒種染料的配成混合液， 在一定條件下展開(kāi)，檢查其分離度大小來(lái)判別的。在實(shí)呩工作屮一般不測(cè)定活度，但在上述規(guī)定活 化的條件制備薄層板的活度一般在n m級(jí)，注意的是活化好與薄層板應(yīng)在硅膠干燥劑環(huán)境下保存 備川。三、點(diǎn)樣：1點(diǎn)樣器簡(jiǎn)介：a層析用微景吸管10w、毛細(xì)管；以上是毛細(xì)管類，前者是廠家生產(chǎn)的成品，者在實(shí)驗(yàn)室制備或 利川其它實(shí)驗(yàn)用毛細(xì)管，但其內(nèi)徑應(yīng)在01mm以內(nèi)，

8、作定性用。b定量用毛細(xì)管、微量注射器：兩者均用于定景的薄層層析，前者奮規(guī)格05、1、2-lopl主要 是進(jìn)口產(chǎn)品 usdiummondscientificco,微m：注射器規(guī)格有 5j.il> 10gk 15pl、25gk 50gk 100pl， 一般5-1 opl作定s薄層用，用前要將針尖稍磨平以免點(diǎn)樣時(shí)刺傷薄層使之損失造成定s不準(zhǔn)。2點(diǎn)樣：位置距底邊10-15cm”斑點(diǎn)直徑3mm最大不過(guò)5mm點(diǎn)間距兩邊點(diǎn)距溥層邊緣15-20cm" 且薄層板兩邊去棹2mm左右的吸附劑，露出玻璃板，以防止邊緣效應(yīng)。方式分為：手工點(diǎn)樣，自動(dòng)點(diǎn)樣。手工點(diǎn)樣操作注意點(diǎn)：手工點(diǎn)樣一般用毛細(xì)管。接觸吸附

9、劑表ifii角度要正確，要迅速，以免點(diǎn) 樣斑點(diǎn)過(guò)大。點(diǎn)樣吋用電吹風(fēng)吹干溶劑量（特別是用熱風(fēng)吋）要用間歇式。點(diǎn)樣量不易過(guò)大。自動(dòng)點(diǎn)樣簡(jiǎn)介：linomat點(diǎn)樣儀:用氮?dú)鈱Ⅻc(diǎn)樣頭上點(diǎn)樣液噴到溥層上，即噴上技術(shù)，可點(diǎn)不同 形狀樣品，lgl-500gl均可點(diǎn)。nanomnt點(diǎn)樣液：用磁性點(diǎn)樣尖控制毛細(xì)管與薄層表而接觸，借毛細(xì)管作用點(diǎn)樣，稱毛細(xì)管式微fi 點(diǎn)樣器。全自動(dòng)點(diǎn)樣tlcsamplerll利用調(diào)節(jié)點(diǎn)樣速度控制原點(diǎn)人小一樣。網(wǎng)、展開(kāi)：所謂展開(kāi)就是層析過(guò)程，一般/十:特定的層析槽中進(jìn)行，層析槽通常為一有蓋密閉的玻璃體，能 防止溶劑揮發(fā)和形成一個(gè)合適的層析環(huán)境。1預(yù)飽和悶題：在層析之前，使層析槽的空間被

10、展開(kāi)劑蒸汽完全飽和的過(guò)程稱之預(yù)飽和，一般 認(rèn)為預(yù)飽和對(duì)分離結(jié)果有好處，但我們認(rèn)為要根據(jù)實(shí)際悄況具體分析，從下面幾方面來(lái)進(jìn)行討論。a出現(xiàn)邊緣效應(yīng)時(shí)：易出現(xiàn)邊緣效應(yīng)的嵌開(kāi)系統(tǒng)，預(yù)飽和30分鐘能有效地克服，特別對(duì)含有極 性差異人的溶劑系統(tǒng)吋較好。b展丌劑分層：在浞合展丌劑屮如吸附力較強(qiáng)的溶劑占的比例較小的（10）就有發(fā)生展丌劑分 層的可能，預(yù)飽和能使吸附劑_i:事先結(jié)合飽和蒸汽中溶劑系統(tǒng)，這樣就可避免展開(kāi)劑分層。c展開(kāi)劑蒸汽對(duì)薄層影響：展開(kāi)劑中沸點(diǎn)低的溶劑不斷接觸薄層板上，t1.越犇上部的部位置越 多，這樣對(duì)rf值大的斑點(diǎn)移動(dòng)距離影響大。2展開(kāi)方式：上行、卜'行、乎行、同心法，一般常規(guī)檢驗(yàn)中

11、，使川上行法，該法操作簡(jiǎn)便，速 度適巾。展開(kāi)注意點(diǎn)：環(huán)境溫度及濕度，溫度一般不高于3（rci（rc-3o°c”濕度對(duì)展開(kāi)劑中含水的系 統(tǒng)尤其注意"過(guò)干過(guò)濕都會(huì)影響已達(dá)成的含水量平衡。五、檢測(cè)方式：冇色化合物的位置易于檢出，這里主耍討論無(wú)色化合物的檢測(cè)方式：1物現(xiàn)方法：主要紫外燈下檢測(cè)，利用物質(zhì)在254、365nm這兩個(gè)肀色光下產(chǎn)生.不m顏色不m強(qiáng)度災(zāi)光來(lái)檢測(cè)” 或利用在該光下不產(chǎn)生熒光而在熒光板上成為暗斑的方式檢測(cè)。2化學(xué)方法：主要指妞色劑妞色法：妞色劑分通用型和專屬型。通用型能廣泛的與不m類型化合物反應(yīng)。專屬 型對(duì)某類化合物，共冇某種功能基化合物起反應(yīng)。常見(jiàn)通用型並色劑冇

12、碳化試劑（含不m濃度的酸）、磷鍆酸、三 氯化銻、還冇水。專屬型並色劑，較多、復(fù)雜、具體物質(zhì)可照藥典操作及杏閱冇關(guān)文獻(xiàn)資料。具體檢測(cè)方法分述如 下。a蒸汽妞色法：利用一些姑色劑蒸汽與樣品組分妞色，如碘、溴、氨氣等。 b浸漬敁色法：配制的敁色劑倒入界器屮，將展好的溥層板放入屮，一般浸入兒秒鐘即可。 c加熱妞色：為了加速反應(yīng)，常在105-110°c下烘至斑點(diǎn)淸晰。d噴霧敁色：敁常見(jiàn)、敁色劑用s少，常與加熱法配合使用。3生物方式：將漿些特定細(xì)苘的凝膠混懸液倒在展開(kāi)后的傅層板上，用適當(dāng)溫度培養(yǎng)一段吋間，以此檢測(cè)架些 兵冇抑茼或殺茼的活性物質(zhì)。六、定量:1斑點(diǎn)刮取定s:刮取隨行對(duì)照品同位置供試品

13、的斑點(diǎn)，用適當(dāng)溶媒提取后，用紫外分光法、氣相法、原子吸收分光光度等色譜 手段測(cè)定。2許接定s:a比斑點(diǎn)而積：用毎格lmm2透明格紙蓋在溥層板上測(cè)s斑點(diǎn)所占而積mm2與對(duì)照品相互比較，定最誤差在 10-20之間。b辨層?jì)D描法：原理：同比色法，似由于溥層板而粗糙不平，薄層斑點(diǎn)的吸光度與含:®之間的關(guān)系，只冇在含:®很低的時(shí)才符 合比爾定律，而此時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線是芎曲的，造成巧曲的原因是光在混濁和表而粗糙的寧透明固體上產(chǎn)蟲(chóng)了敗射，解 釋這個(gè)原因的knbelka和timk在1931年創(chuàng)立了 kn-mu現(xiàn)論，推異丫 k-m微分方程，通過(guò)該現(xiàn)論可求得散參數(shù)sx 不同性質(zhì)吸附劑的sx不同這樣

14、就可將吸光度與含制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線近似直線”符介測(cè)定要求。實(shí)際工作原則是：用一束長(zhǎng)寬可以調(diào)節(jié)的一定波長(zhǎng)一定強(qiáng)度的光，照射在薄層板斑點(diǎn)上，進(jìn)行掃描，用儀器測(cè) 量通過(guò)斑點(diǎn)的光束強(qiáng)度的變化，從而達(dá)到定的e1的。測(cè)定方式分類：反射法：測(cè)最反射光的強(qiáng)度。透射法：測(cè)最透射光的強(qiáng)度。掃描方式分類：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)法、單光束法；單波長(zhǎng)、雙光束法；雙波長(zhǎng)法。薄層拍描儀的組成：光源、單色器、薄層板臺(tái)架及驅(qū)動(dòng)裝置、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理儀。操作方法步驟有供試品前處理、點(diǎn)樣、肢開(kāi)、上機(jī)掃描、數(shù)據(jù)處理。外標(biāo)法主要測(cè)定技術(shù)桁標(biāo)精密稱取對(duì)照品配制成高、低兩種濃度，供試品溶液制備至少兩份，甸份對(duì)照品溶 液和供試品溶液在同一薄層板k點(diǎn)樣不少于2個(gè)

15、斑點(diǎn)，交叉點(diǎn)樣，各份溶液所點(diǎn)斑點(diǎn)測(cè)定結(jié)果對(duì)應(yīng)平均值的偏 差均不得人于3,供試品測(cè)定結(jié)果對(duì)平均值的偏差不得人于3。注意事項(xiàng):供試品的響應(yīng)值應(yīng)在高低標(biāo)準(zhǔn)w,響應(yīng)值之問(wèn)則應(yīng)予以調(diào)糧:色譜斑點(diǎn)分離度應(yīng)在15以上"至少不能 少于10,且背景千擾盡s:??；斑點(diǎn)應(yīng)呈一致性，供試品斑點(diǎn)與對(duì)照品斑點(diǎn)顏色應(yīng)一致（日光、熒光、紫外光下檢視）， 斑點(diǎn)的光譜閿應(yīng)s木一致；測(cè)定記錄內(nèi)容應(yīng)包括色譜閿、積分記錄、工作曲線及i叫歸a程和相關(guān)系數(shù)，測(cè)定結(jié)果的 計(jì)算應(yīng)用兩點(diǎn)法或1"1歸a程（多水平校正法）計(jì)算。結(jié)果h算：工作曲線經(jīng)過(guò)原點(diǎn)可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量計(jì)算；工作曲線不過(guò)原點(diǎn)必須用外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算。計(jì)算公式 如下

16、：點(diǎn)法： mi樣品ai樣品xmi標(biāo)準(zhǔn)/ai標(biāo)準(zhǔn) 二點(diǎn)法:mi樣品bxai樣品aa 1 /2mi lmi2-1 /2bai 1 ai2bmi2-mil/ai2-ai1mi點(diǎn)樣s:ai斑點(diǎn)峰而稅mi 1、mi2對(duì)照品點(diǎn)樣最ail、ai2對(duì)照品斑點(diǎn)峰而積»返回上-頁(yè)程序維護(hù):湖北省藥檢所網(wǎng)站實(shí)訓(xùn)七薄層板的制備技術(shù)和薄層分析的點(diǎn)樣技術(shù)訓(xùn)練一、課前預(yù)習(xí)內(nèi)容一供測(cè)定黃曲霉毒素用的硅膠g薄層板的制備取適量硅膠g粉于研缽中，加相當(dāng)于硅膠g量的2-3倍左右的水，用力研 磨1-2分鐘，至成糊狀后立即倒在5*20cm的薄層板中心線上，快速左心傾斜， 使糊狀物均勻地分布在整個(gè)板面上，厚度約為0.25mm，然后平放于平的桌面上干 燥15分鐘，再放入100°c的烘箱內(nèi)活化2小時(shí)，取出放入干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?。另一方法是：稱取約3g硅膠g,加相當(dāng)于硅膠量的2-3倍左右的水，用力研磨1-2分鐘， 至成糊狀后立即倒入涂布器內(nèi)，推鋪成5x20cm、厚度為0.25 mm的薄層板三塊。 于空氣中干燥約15分鐘后，在100°c下活化2小吋，取出放入干燥器中保存。二供測(cè)定苯甲酸、山梨酸用的聚酰胺薄層板的制備稱取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加約15ml水，研磨3分鐘，在10x20cm玻璃板上使其均勻即涂成0.25-0.30mm厚的薄層，