細菌內(nèi)毒素的研究進展

1、細菌內(nèi)毒素的研究進展中文摘要及關鍵詞(1)英文摘要及關鍵詞(2)-a-x1刖吞(3)1細菌內(nèi)毒素的化學組成(4)2細菌內(nèi)毒索的生物學活性(4)3內(nèi)毒素的病理生理作用機制 (5)4細菌內(nèi)毒素受體的研究進展 (6)(6)4.1 cd144.2 toll 樣受體(7)4.3 清道夫受體 (8)(9)4.4 lbp5細菌內(nèi)毒素的檢測方法 (10)5.1蛍氏實驗(10)5.1.1半定量測定-凝膠法(10)5.1.2定量測定(10)5.1.2.1濁度法(比濁法)(10)5.1.2.2顯色基質(zhì)法(比色法) (11)5.1.2.3酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa) (11)5.2免疫學方法 (11)5.3生物學

2、方法 (11)5.4化學發(fā)光法 (11)5.5流式細胞術(11)6內(nèi)毒素的制備(11)7內(nèi)毒素抗體的保護作用(12)參考文獻(13)致謝(15)本文從細菌內(nèi)毒素的化學組成、生物學活性、致病機理、內(nèi)毒素的制備與檢 測及內(nèi)毒素受體的作用等方面，對細菌內(nèi)毒素的研究進展進行了綜述，并對木領 域的研究方向及前景進行了討論。關鍵詞：內(nèi)毒素；生物學活性；致病機理；檢測方法abstractthis article from the bacterial endotoxin in chemical composition, biological activity, the pathogenic mechanism

3、, within the endotoxin and the preparation and testing, endotoxin receptor in the role of bacterial endotoxins of progress were reviewed, and this field of study direction and prospects were discussed.key words： endotoxin; biological activity; pathogenic mechanism; examination method內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多

4、糖(lps)成分，是與細菌細胞壁牢固 結(jié)合的一種大分子結(jié)構物質(zhì)，只有在細菌死亡時、繁殖時或人工破壞時，才釋放 到細胞外，發(fā)揮其各種效應，細菌內(nèi)毒素首先由boivin等1933年用三氯醋酸 口鼠傷寒桿菌中提出，當時因其一般蛋白質(zhì)反應呈陰性，而稱z為脂多糖(lps)o 隨后其他學者用不同方法從各種革蘭氏陰性菌中提出與lps相似的物質(zhì)，該物 質(zhì)具有多種毒性反應，為區(qū)別于外毒素，而稱之為內(nèi)毒素。另一些學者則根據(jù)其 具有0型菌的特異抗原性，命名為0抗原或菌體抗原，以區(qū)別于h抗原或鞭毛 抗原。脂多糖的類脂a是lps的“毒力中心”。正常機體腸腔內(nèi)含冇大量細菌及 內(nèi)毒素，有報道稱正常腸黏膜可允許少量內(nèi)毒素進入

5、門脈，而少量內(nèi)毒素對促使 肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)處于激活狀態(tài)有一定意義。當機體受到創(chuàng)傷(包括手術)、燒傷、 感染、和接受長期傳統(tǒng)的腸外營養(yǎng)吋，腸黏膜有可能發(fā)生通透性增高，導致細菌 和內(nèi)毒素移位。在某些情況下，細菌感染可能被控制，但內(nèi)毒素仍可通過“漏” 的腸黏膜，引起炎癥的激活及細胞介質(zhì)的釋放，導致全身炎癥反應綜合征(sirs)、 多器官功能不全綜合征(mods)甚至多臟器功能衰竭(mof) 2因此認為，革 蘭氏陰性菌釋放的內(nèi)毒索是造成革蘭氏陰性菌感染的臨床和實驗室表現(xiàn)的原因。 h革蘭氏陰性菌血培養(yǎng)需要花費數(shù)天吋間，因此細菌內(nèi)毒素的測定對早期診斷病 情比細菌移位更有意義。有研究結(jié)果表明，內(nèi)毒素血癥是臨

6、床上有用指標，預測 革蘭氏陰性菌敗血癥的陽性預測值為48%,而沒冇內(nèi)毒素血癥就可基本排除發(fā)生 血癥的可能，陰性預測值為99%3o1內(nèi)毒素的化學組成細菌內(nèi)毒素是由lps、蛋白質(zhì)和磷脂組成的復合物，分子量約1"°20"° 道爾頓。內(nèi)毒素與菌休細胞壁密切相連，其活性成份是lps,而蛋白質(zhì)和磷脂與 內(nèi)毒素的活性無關。lps為革蘭氏陰性菌外膜屮的脂多糖成分。它是由三部分組 成：仃）0特異性側(cè)鏈；核心多糖；（3）類脂a。o特異性側(cè)鏈db 20-40個重 復單位組成，每個重復單位曲37個糖分子組成。它是細菌表面的主要抗原，決 定型的特界性，核心多糖可以分為連接o特異性

7、側(cè)鏈的外核部分和連接類脂a 的內(nèi)核分。核心多糖相對穩(wěn)定，同一菌屬結(jié)構相同。內(nèi)核部分含有庚糖和2酮基 3脫氧辛酸（kdo）兩種特殊的糖類分子。它們在lps結(jié)構屮起著連結(jié)多糖與類 脂的作用。其中類脂a是lps活性不可缺少的部分，可視作lps的“生物活性 中心”，是抗原活性部位，保存著lps的各種生物學活性。在類脂a成分中， 脂肪酸約占70%80%,各種細菌類脂a的脂肪酸性質(zhì)和排列不同。類脂a的 生物學活性主要在于其以酯鍵相連的脂肪酸，若其被水解，類脂a或lps即失 去活性。類脂a具冇免疫原性，注入動物全內(nèi)可以產(chǎn)生相應抗體?；趯︻愔琣 整個成份、結(jié)構、功能有了詳細了解，80年代前后報道了合成類脂a

8、,并將合 成類脂a與天然類脂a的生物學活性作了比較，表明合成類脂a具有天然類脂 a的某些活性，只是活力比天然類脂a低。2內(nèi)毒素的生物學活性細菌內(nèi)毒素的生物學活性多種多樣，尤其在機體內(nèi)的表現(xiàn)，錯綜復雜，各單 項活性z間常相互聯(lián)系，相互促進或制約。在體內(nèi)或特定的體外條件下，所表現(xiàn) 的活性，冇時為數(shù)種活性綜合作用的結(jié)果。在不同的實驗條件下，包括不同的機 體、不同的內(nèi)毒素制品、不同的劑量、不同的測試方法等，所得到的結(jié)果也不一 致?，F(xiàn)將其生物學活性總結(jié)如下：第一，內(nèi)毒素具有致熱性，可使人和動物發(fā)熱, 體溫升高；第二，給動物注射內(nèi)毒素，早期白細胞數(shù)量減少，后期白細胞數(shù)量明 顯增加；第三，內(nèi)毒素可引起血小板

9、粘附、聚集、觸發(fā)凝血系統(tǒng)，導致彌漫性血 管內(nèi)凝血（dic）。具有激活凝血系統(tǒng)作用；第四，內(nèi)毒索既能激活補體活化的 經(jīng)典途徑，也能活化旁路途徑。活化過程屮產(chǎn)生的c%、c%具有過敏性毒素作用； 第五，內(nèi)毒素可導致動物發(fā)生什瓦茨曼（shwartzman）現(xiàn)象；第六，內(nèi)毒素進入動 物體內(nèi)可導致心肌損害、肺損傷、肝衰竭、腎衰竭、胃腸道損傷等多器官功能障 礙；第七，內(nèi)毒索具冇較強的抗原性，能刺激機體產(chǎn)生相應的抗體，同時也能增 強機體非特導性免疫力，即誘導抗感染的特異性抵抗力；第八，內(nèi)毒素具有免疫 佐劑活性。內(nèi)毒素作用于靶細胞產(chǎn)生細胞因子tnf、il-k il6等，可被作為復 合免疫佐劑；第九，內(nèi)毒素注射入

10、實驗動物，常可導致動物死廣。此外，內(nèi)毒素 還能導致懷孕動物流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎；抑制紅細胞生成；具有致嫩和抗嫩作用； 刺激淋巴細胞冇絲分裂；卷細胞溶解物(卷試劑)的凝集；腫瘤細胞壞死作用等。 3內(nèi)毒素的病理生理作用機制內(nèi)毒素(endotoxin, et)主要通過刺激單核細胞和巨噬細胞，使其產(chǎn)?？诩?胞介素(il-1)、腫瘤壞死因子(tnf)、干擾素(ifn)、巨噬細胞炎癥蛋白1 (mip- 1)、口細胞致熱源(lp)和睫狀體促神經(jīng)因了(cntf)等細胞因了而致病。lps所引 起炎癥反應的病理作用分系統(tǒng)和細胞兩個方面。在系統(tǒng)方面，lps導致凝血系統(tǒng) 活化，纖維蛋白形成增加，纖維蛋白降解減少。凝血系統(tǒng)

11、出現(xiàn)的這些改變造成臨 床患者發(fā)生彌漫性血管內(nèi)凝血(dic) o在細胞方面，lps可刺激一些效應細胞產(chǎn) 生活性因子，尤其是lps刺激單核細胞巨細胞和內(nèi)皮細胞產(chǎn)生多種促炎癥細胞因 了，如n17-n> 11-ibo受lps刺激細胞產(chǎn)生的細胞因了，迅速活化不同組織器官 的細胞，導致機體代謝、激索水平和神經(jīng)內(nèi)分泌的改變，進而造成細胞功能的異 常和不同器官的進行性衰竭。研究證明，內(nèi)毒素所引起的各種生物學效應是通過 與靶細胞作用而誘導這些細胞產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì)和細胞因子表現(xiàn)出來的，并非 內(nèi)毒素本身的效應。這些靶細胞包括單核巨噬細胞、b淋巴細胞、粒細胞、血小 板、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等。內(nèi)毒素誘導產(chǎn)生的

12、炎癥介質(zhì)和細胞因了有c3“、 c5a>內(nèi)啡吠、凝血因子、paf、tnf、il1、il6、il8、ifn等。lps是目前所 知誘導il1和tnf最重要的因素。內(nèi)毒素誘導細胞因子的合成與分泌。已經(jīng) 證明動物細胞上有類脂a受體的存在，lps與靶細胞的結(jié)合依賴于靶細胞的lps 結(jié)合蛋白(lbp)和cd14o lps和lbp形成lps-lbp復合物后，再與cd14結(jié)合，誘 導胞膜及胞漿內(nèi)蛋口磷酸化，然后啟動細胞因了基因表達，產(chǎn)生細胞因了。過墩 性毒索內(nèi)毒索在激活補體活化過程中產(chǎn)生過敏性毒索c%、c5a，二者均可使肥大 細胞或嗜堿性細胞產(chǎn)牛組織胺，引起血管擴張，增加毛細血管的通透性，使平滑 肌收縮和

13、支氣管痙攣等。此外，c5a還可誘導tnf、il1等的分泌，參與炎癥反應。 內(nèi)毒素可誘導中性粒細胞、嗜堿性細胞、血小板、上皮細胞等分泌paf。paf能 引起了血小板聚集釋放活性物質(zhì)，使平滑肌的收縮和血管通透性增高。血小板聚 集，觸發(fā)凝血系統(tǒng)，引起彌漫性血管內(nèi)凝血。血小板聚集或參與形成的微血栓栓 塞于各臟器，是各肌器功能衰竭的重要原因。細胞因子tnf和il1是內(nèi)毒素刺激 單核巨噬細胞等所產(chǎn)生的兩種主要細胞因子，它們能作用于各類細胞增強與促 進局部和全身炎癥過程有關的基因表達以及增強內(nèi)皮細胞粘附因了的表達。tnf 和il1作用相似，均為內(nèi)源性致熱原，可導致發(fā)熱，促進白細胞滲岀，破壞血 凝抗血凝平衡，

14、抑制抗凝血機制，導致血栓形成等。內(nèi)毒素誘導靶細胞產(chǎn)生細 胞因子，一方面可激活機體局部和整體的免疫系統(tǒng)參與清除細菌感染；另一方面 如果細胞感染嚴重，大量細菌在血屮繁殖，使循環(huán)血中堆積大量內(nèi)毒素，產(chǎn)生大 量細胞因了，則可能導致內(nèi)毒素性休克。內(nèi)毒素受體近年來有關內(nèi)毒素受體的研究報道的非常多，已發(fā)現(xiàn)了 4類分子家族與lps脂質(zhì)a部分結(jié)合參與炎癥信號轉(zhuǎn)導，包描cd14、脂多糖結(jié)構蛋口(lipopolysaccharide binding protein, lbp) > tbll樣受體(tblllike receptors, tlrs) > 清道夫受體、t和卩2白細胞整合素(cdlla/cd1

15、8 , cdllb/cd18 , cdllc/cd18等)。目前冇關卩2白細胞整合索的文獻報道較多，現(xiàn)重 點對前四者的研究進展進行闡述。4.1 cd14 (分化抗原14)cd14是最早確認的lps受體。1985年冇人用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)了單核細胞表 面、髓樣細胞(myeloid cell)培養(yǎng)上清液和止常人血漿中一種55ku的蛋口質(zhì)，后 來這種蛋白質(zhì)在國際白細胞抗原研討會(international worksphos on leukocyte antigens)±被命名為cd14,成為髓樣細胞分化抗原屮的一員。動物體內(nèi)有兩種 形式的cd14, 一種是膜結(jié)合形式(mcd14),主要分布于

16、髓樣細胞表面，并作為 這類細胞分化的標志，mcd14通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細胞膜上，相對分 了質(zhì)量約為515xi04；另一種是可溶性形式(scd14),主要存在于血清中， 介導非髓樣細胞的激活，相對分子質(zhì)量約為418x,04516"叫scd14主要來自髓 樣細胞表面mcd14的脫落，或由髓樣細胞合成后分泌。lps入侵機體后首先 由單核細胞對它產(chǎn)生識別與應答作用，產(chǎn)生一系列細胞因子：腫瘤壞死因子 -a(tnf-a) 口細胞介素-l(il-l). 口細胞介素-6(il-6)等。而在這個過程中cd14 起主要的介導作用，cd14可以幫助lps結(jié)合于單核細胞，實現(xiàn)機體識別lps 的第一步。

17、研究發(fā)現(xiàn)，阻斷l(xiāng)ps與cd14的結(jié)合可抑制lps對單核細胞、屮性 粒細胞的刺激作用。將cd14基因轉(zhuǎn)入大鼠未成熟b細胞后，此細胞對lps的 敏感性捉高1000倍。更直接的實驗發(fā)現(xiàn)，利用標記的lps可以直接結(jié)合于 細胞表面。利用elisa法證實了 scd14能夠直接與lps結(jié)合。從而可以推斷， cd14其生物學功能主要是識別、結(jié)合lps或lps/lbp復合物，介導lps所致 的細胞反應，在lps性炎癥反應、內(nèi)毒素休克等病理反應屮起著作用。若能夠 完全封閉cd14的功能，特異性的阻斷cd14與lps及l(fā)ps/lbp復合物結(jié)合， 就能夠防止或屮止lps性炎癥反應、內(nèi)毒素休克等病理反應的發(fā)生，對丁臨床

18、 治療內(nèi)毒素血癥、內(nèi)毒素休克等將會有重耍意義。許多資料顯示，mcd14是 細胞表面被低劑量lps激發(fā)炎癥反應的關鍵受體(人劑量lps刺激不依賴于 mcd14)o lps可通過3種方式與cd14結(jié)合，包括完整細菌細胞壁上的lps、 聚集的lps分子團以及l(fā)ps單體。然而，lps被cd14識別并不是直接的，它 需要脂多糖結(jié)合蛋白(lbp)催化。科學家述研究發(fā)現(xiàn)scd14可以介導lps對缺 乏cd14的單核細胞pnh細胞具有刺激作用。由此可見，雖然機體只有少數(shù)幾 種細胞口j以表達cd14,但是scd14可以介導其他cd14陰性細胞(血管內(nèi)皮細 胞、上皮細胞)對lps產(chǎn)生應答作用，參與lps在體內(nèi)的信

19、號轉(zhuǎn)導，激活機體的 免疫系統(tǒng)，當前大量的研究都集中在免疫細胞對lps的信號轉(zhuǎn)導作用，但是對 莫他非免疫細胞的研究還不夠充分，有待更深入的研究。4.2 toll 樣受體(tolllike receptors, tlrs)近年來信號受體toll的發(fā)現(xiàn)為lps受體的研究找到了突破點。目前發(fā)現(xiàn)的 tlr成員有12利主要分布于一些免疫器官，例如脾臟和胸腺等。參與lps信 號跨膜傳遞的tlr主要有tlr2、tlr4和tlr5。toll與其配體spatzle結(jié)合而 被激活，可引起胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子dorsal的抑制因子cactus的降解、分離，從而 dorsal被激活而啟動機體的免疫防御反應。由于它對于機體免

20、疫系統(tǒng)的重要性， 對toll信號受體的研究冇可能明確革蘭氏陰性菌感染的機制，從而為此類疾病的 治療帶來有效的手段。由于toll的lrr區(qū)域具有識別蛋口、肽、碳氫化合物等的功能，toll極有 可能是lps的識別受體，將刺激信號傳入胞內(nèi)。toll樣受體的胞內(nèi)段含toll同 源結(jié)構域(toll-homolgy domain, th do-main), th結(jié)構域與il-1r胞漿結(jié)構具 有高度的同源性,又將th結(jié)構域稱為toll/il-1r(tir)同源區(qū)，這是tlrs和 il1r向下游傳導信號的核心元件。兒乎所有的toll均參與天然免疫反應，但它 們的天然配體還不清楚，目前對tlrs研究得較多的是t

21、lr2和tlr4。盡管革 蘭氏陰性菌各種成分相差很大，但lps為革蘭氏陰性菌胞壁所共有，它包括相 同脂質(zhì)a和具種間差異的多糖成分，toll受體僅識別脂質(zhì)a,這樣機體就能識別 整個革蘭氏陰性菌病原菌，科學家將存在于胞壁為大多數(shù)微生物所共有的一類分 子稱為病原相關分子物質(zhì)結(jié)構(pathogen-associatedmolecular patterns, pamps), toll受體所識別的結(jié)構正是pampso人toll與果蠅toll蛋白的同源性以及在免 疫防御反應中起重耍作用，可以看出toll受體進化的保守性，它是維持生命不可 缺少的成分。4.3清道夫受體(sr)主要分布于巨噬細胞表面，尤其是肝臟

22、的枯否氏細胞上，有sr-a和sr-b 兩種形式，其中sr-a參與lps的識別、結(jié)合和降解。牛sr是由3個77ku單 體糖蛋口組成的三聚體，廣泛分布于不同的器官組織，其中巨噬細胞是sr的主 要表達場所。最早發(fā)現(xiàn)sr的功能是其參與動脈粥樣駛化的病理過程，它通過攝 取氧化型低密度脂蛋白、促進膽固醇沉積，從而使動脈粥樣硬化發(fā)生。近年研究 發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞表面sr是參與宿主早期防御的重要受體。sr可與革蘭氏陰性 菌細胞壁或循環(huán)中游離的lps結(jié)合，這種結(jié)合并不引起炎癥反應，但在清除和 滅活lps過程中發(fā)揮重要作用。lps與sr結(jié)合后冇何病理生理作用呢？據(jù)報道，用lps刺激小鼠腹腔巨噬 細胞，發(fā)現(xiàn)lps與sr

23、a結(jié)合能阻止一個41ku蛋白的酪氨酸磷酸化，使no合 酶產(chǎn)生降低，從而使no合成與釋放顯著減少。從缺乏sr-a的小鼠(srko)觀 察到，srko對lps非常敏感，低劑量lps可導致大量tnf-a等細胞因子產(chǎn)生, 用抗tnf-a抗體可降低動物死亡率。由此可見，sra在巨噬細胞上表達可清除 lps,減少炎性因子的釋放，保護宿主防御功能。sr還冇一種“模式識別"能力， 通過其陽離子膠原區(qū)與配體的多聚陰離子結(jié)合，對不同種類的配體均有高度的親 和力。sr-a主要在巨噬細胞上表達，而肝臟枯否氏細胞占全身巨噬細胞90%以 上，因此肝臟是清除代謝產(chǎn)物及毒物的主耍器官。在無血漿的情況卜用lps與 大

24、鼠枯否氏細胞作用，發(fā)現(xiàn)多種多聚陽離子可阻止必ilps與枯否氏細胞相結(jié)合, 說明了 lps與枯否氏細胞結(jié)合位點是在sr上。流式細胞分析顯示，cd14在枯 否氏細胞上表達量極低，且lps誘導的細胞因子反應不依賴于血漿，由此推測 存在著一個獨立的、不依賴于cd14的sr和（或）tlrs機制來介導枯否氏細胞 活化。采用無菌大鼠進一步研究指出，腸道內(nèi)微生物菌群（特別是革蘭氏陰性菌） 在調(diào)節(jié)依賴lps而不依賴cd14的信息通路中冇潛在作用。然而，冇人通過基因 缺失模型證明，雖然小鼠巨噬細胞sr-a對lps誘導的膿毒癥耐受，但人單核巨 噬細胞受到lps攻擊后sr-a表達反而下調(diào)，不利于抗炎反應。4.4 lb

25、p （lps結(jié)構蛋白）脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein,lbp）在體內(nèi)貝有l(wèi)ps增 敏作用和中和lps作用。一方面口j促進lps多聚體解體成單體，加速lps與cd14 的結(jié)合，從而增強靶細胞對lps的敏感性，并經(jīng)cd14和tlr4進行跨膜信號傳遞, 引起細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導及細胞因子的產(chǎn)生，觸發(fā)一系列炎癥反應；另一方面，lbp 可催化lps與脂蛋白結(jié)合，加速體內(nèi)lps的清除，具冇中和lps作用口x機體受 lps刺激后lbp可升高50-100倍。由452個氨基酸組成，其中靠近n末端94位的精 氨酸和95位的賴氨酸殘基對lps結(jié)合是必需的，替換這兩個氨

26、基酸殘基則使lps 的結(jié)合能力減弱甚至消失，c末端與轉(zhuǎn)移lps至cd14的功能有關。在細胞對lps 的應答過程中，lbp主要起催化作用。有人發(fā)現(xiàn)lbp存在時，0.01lng/m啲lps 即可以刺激兔腹腔巨噬細胞產(chǎn)生tnf-a,使lps的作用增敏1000倍。此外，lbp 還可以增強lps誘導的粘附分了的表達及花生四烯酸代謝，從血漿中去除lbp能 明顯減少lps引起的細胞活化。lbp在促使lps與cd14結(jié)合及在lps發(fā)揮生物學 活性屮起著重要作用，發(fā)現(xiàn)從lbp基因敲除（lbp-/-）小鼠分離的血清不能使lps 運送至cd14,提示沒有任何其他血清成分可以代替lbp的作用；lbp-/-小鼠靜脈 注

27、射lps后，血漿屮tnf-a含量明顯降低，死亡率下降。更直接的實驗發(fā)現(xiàn)，只 有l(wèi)bp存在時標記的lps才能結(jié)合單核細胞，同時看到標記的lbp也結(jié)合到細胞 表面，并且發(fā)現(xiàn)結(jié)合的半衰期相同，從而認為lbp不僅起到催化lps與cd14結(jié)合 的作用，而且與lps、cd1形成一個復合物，結(jié)合到細胞表面，為lps-lbp-cd14 三休的理論奠定了基礎。雖然機體最先識別lps的是lbp/cd14系統(tǒng)，但是它們 本身與信號的跨膜轉(zhuǎn)導無關，因為cd14無胞內(nèi)成分也無與此相連接的酶。因此 冇學者提岀了3種lps信號跨膜轉(zhuǎn)導的模型。模式i為單受體模型，uplps/lbp 與cd14結(jié)合后，由另一能夠識別mcd14

28、gpi結(jié)構的跨膜蛋白將信號轉(zhuǎn)導到細胞 內(nèi)。模式ii和模式iii則認為lps受休是一個多聚體，由配體結(jié)合亞單位mcd14 和一個附加的跨膜蛋白轉(zhuǎn)導信號。lps信號傳導的跨膜結(jié)構成分至今尚未研究清 楚。5細茵內(nèi)毒素檢測方法5.1蜜試驗法1956年，johns hop hins大學的動物學家bang博士發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性細菌的 粗制品能使磁的血細胞凝聚而死廣。19631964年該大學醫(yī)學院血液室的levin 和bang合作對細菌引起蜜血凝聚的機制進行了深入的研究，用提純的內(nèi)毒素和 蛍血細胞溶解物證明了蛍血凝聚機制是一種酶反應。近十余年來，細菌內(nèi)毒索試 驗的方法已取得很大進展，口前有凝膠法(cel-clo

29、t-techique)；比濁法(turbidmeuic assay)；比色法(colori-metricas-say)和免疫學方法(immunology method)等。5.1.1半定量測定凝膠法凝膠法是齊國藥典細菌內(nèi)毒素檢查的首選方法。它是根據(jù)蜜試劑與細菌內(nèi)毒 索產(chǎn)生凝集反應的機理，終點判斷采用翻轉(zhuǎn)180。法。此法操作較簡單、經(jīng)濟， 不需要專用測定設備，可在0.03fu/ml的范圍內(nèi)進行半定量測定。其缺陷為特異 性不強、精密度、定量性較差。5.1.2定量測定隨著蜜試驗方法的測定儀器的不斷完善，內(nèi)毒素測定已向微量定量方向發(fā) 展。定量測定在常規(guī)藥品檢查、生產(chǎn)過程質(zhì)控、各種除熱原方法的評價、特殊

30、樣 品的檢查(如血液、尿液、腦脊液)等方面，與凝膠法相比具有靈敏、快捷、準確 的特點。據(jù)統(tǒng)計，當今美國蛍試劑的應用當中，超過50%的檢查采用了定量方法。 5.1.2.1濁度法(比濁法)濁度法是利用分光光度計測定凝膠形成過程中伴隨的濁度變化，從而定量測 定細菌內(nèi)毒索，可以分為終點比濁法和動態(tài)比濁法。通常在0.006-300eu/ml范 圍內(nèi)進行定量測定。動態(tài)比濁法是美國官方認可的檢查法，該方法已成為定量法 的主流之一。此法操作簡單速度快，靈敏度高，檢測范圍較寬，但需要精密的儀 器。5.1.2.2顯色基質(zhì)法（比色法）顯色基質(zhì)法是利用凝固酶水解顯色底物產(chǎn)牛的顯色基團使吸光度發(fā)牛變化 而進行定量測定的

31、方法?？梢苑譃榻K點比色法和動態(tài)比色法。該方法靈敏度、精密度高，通常在0.006-300eu/ml范圍內(nèi)測定，但儀器和 試劑昂貴，操作比較復朵。目前主要用于微量內(nèi)毒素測定。目前，在國外細菌內(nèi) 毒索定量法的使用率大約占65%70%,已經(jīng)超過凝膠法，而11還呈上升趨勢。 5.1.2.3酶聯(lián)免疫吸附測定法（elisa）酶聯(lián)免疫測定法（elisa法）基于抗原抗體的酶聯(lián)免疫測定法，目前在國外應 用十分普遍。主要由外加熱原質(zhì)刺激巨嗜細胞后產(chǎn)生的內(nèi)熱原物il-1等，而進 行的定量測定方法。體外人全血熱原檢測方法是近年來國內(nèi)外止在興起的一種研 究熱原檢測的新方法，具有檢測范圍廣，靈敏度高，不同個體血液的結(jié)果差異

32、小 等優(yōu)點國內(nèi)一些學者，已采用卿聯(lián)免疫測定法對體外人全血熱原檢測方法 的可行性進行研究和優(yōu)化，取得了可喜的進展門叫5.2免疫學方法冃而采用的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附檢測法、火箭免疫電泳試驗法、l聚賴 氨酸法、雙抗體夾心法、熒光偏振法、i氣同位索標記法。這些方法的特點是 特異性、準確性高，但其應用尚待大量臨床實踐的驗證，操作尚待進一步簡化。 5.3生物學方法利用lps刺激免疫細胞產(chǎn)生il-k tnf的特性，以標化的細胞系作為靶細 胞，檢測細胞培養(yǎng)上清中的il-k tnf等細胞因了含量，推算出待檢樣本中的 lps含量。5.4化學發(fā)光法應用cr1和cr3受體誘導中性粒細胞的氧化反應作為一個反應平臺，通

33、過 測定內(nèi)毒素對屮性粒細胞的生物學作用來檢測內(nèi)毒素的含量。5.5流式細胞術應用針對內(nèi)毒索表面抗原決定簇的單克隆抗體對內(nèi)毒索進行熒光標定而后 應用流式細胞儀進行檢測。6內(nèi)毒素的制備內(nèi)毒素的制備方法很多，各種方法所得的制品在純度、活性、產(chǎn)量等方面均 有所差異。方法主要冇三氯醋酸法、酚水法、二乙二醇法、水乙醯法、水丁醇法、 酚氯仿石油瞇法等?？谇皯幂^多的是酚水法。7內(nèi)毒素抗體的保護作用內(nèi)毒素具有較強的免疫原性，只需幾十至數(shù)百微克即能明顯誘導小鼠及家兔 產(chǎn)生抗內(nèi)毒素抗體。內(nèi)毒素核心結(jié)構和類脂a在幾乎所有革蘭氏陰性菌z間具 冇明顯的相似性和高度的穩(wěn)定性，而且又是最具生物學活性和毒性的成份，因此 用核心

34、結(jié)構和類脂a統(tǒng)稱為核心糖脂，cgl作為免疫原制備抗體，可獲得具有 廣泛交叉反應性的保護性抗體，從而達到阻斷兒乎所有內(nèi)毒素的病理生理作用。 由cgl產(chǎn)生的抗體具冇與幾乎所有革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素的結(jié)合能力。大多數(shù)科 學家認為，這種結(jié)合能夠阻斷內(nèi)毒素誘導靶細胞或組織釋放炎癥介質(zhì)和細胞因 子，起中和內(nèi)毒索的毒性和促進網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)吞噬清除的功能。臨床研究表 明，抗cgl血清或免疫球蛋白具有明顯的防治革蘭氏陰性菌感染性休克和減少 死亡率的作用。但由于缺乏再次免疫應答，抗體滴度難以控制，導致抗休來源和 標準化工作受到限制，此類抗體難以在臨床上推廣應用。近十年來，應用單克隆 抗體技術制備的抗cgl抗體，克服了以上諸多缺點，臨床上應用也是安全有效 的，具廣闊的發(fā)展前景。還有研究表明，內(nèi)毒索抗體保護作用的大小與所使用的 動物模型和感染的嚴重程度有關。在細菌牛長初期，lps的構建不完全，此吋抗 cgl抗體與核心結(jié)構結(jié)合，能顯示出交叉抗感染的作用。如感染