生化分析儀檢測原理學(xué)習(xí)資料

1、臨床生化檢驗(jinyn)反應(yīng)原理及報告審核檢驗科檢驗科 黃小虎黃小虎第一頁，共60頁。全自動生化全自動生化(shn hu)分分析儀析儀第二頁，共60頁。生化(shn hu)分析儀特點(tdin)優(yōu)點(yudin)亮點亮點自動化機械化的儀器設(shè)備模仿 代替手工操作提高了工作效率 減少了主觀誤差靈敏 準(zhǔn)確 快速 標(biāo)準(zhǔn)化第三頁，共60頁。生化(shn hu)分析儀分類1按結(jié)構(gòu)原理分管道連續(xù)流動式分立式常用離心式干片式急診常用2按測定速度分小型中型大型超大型（模塊式）3按自動化程度分半自動全自動第四頁，共60頁。2004 生化生化(shn hu)分析儀分析儀主要構(gòu)成主要構(gòu)成加樣系統(tǒng)(xtng)供排水系

2、統(tǒng)(xtng)構(gòu)成比色系統(tǒng)光源 比色杯 單色器 檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)樣品轉(zhuǎn)盤 試劑倉 取樣裝置第五頁，共60頁?；驹砼R床生化(shn hu)分析儀最常使用的是分光光度法分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。 第六頁，共60頁。第七頁，共60頁。光吸收曲線(qxin)溶液對不同波長光的吸收程度，通常溶液對不同波長光的吸收程度，通常(tngchng)(tngchng)用光吸收曲線用光吸收曲線來描述。來描述。 在分光光度法中, 以吸光度為縱坐標(biāo), 以波長為橫坐標(biāo)作圖可得光吸收曲線。 濃度不同的同種溶液, 在該種曲線中其最大吸收 波 長

3、 相 同 ， 相 應(yīng)(xingyng)的吸光度大小則不同，同一波長下摩爾吸數(shù)相同。第八頁，共60頁。Lambert-Beer（朗伯-比爾）定律(dngl)當(dāng)一束(y sh)平行單色光通過均勻的非散射樣品時，樣品對光的吸光度與樣品的濃度及厚度成正比 A=kcbA-吸光度 k-吸光系數(shù) c-溶液濃度 b-液層厚度第九頁，共60頁。吸光系數(shù)(xsh)定義：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時測得的吸光度。K值的大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溶液(rngy)溫度和溶劑性質(zhì)等，與溶液(rngy)濃度大小和液層厚度無關(guān)。但K值大小因溶液(rngy)濃度所采用的單位的不同而異。 第十頁，共60頁。討 論：

4、1.Lamber-Beer定律的適用條件(tiojin)（前提）:入射光為單色光溶液是均勻，無散射溶液2.該定律適用于固體、液體和氣體樣品3.在同一波長下，各組分吸光度具有加和性，如果 溶液中同時存在兩種或兩種以上的吸光性物質(zhì) ,則測得的該溶液的吸光度等于溶液中各吸光性 物質(zhì)吸光度的總和，即： A（a+b+c）AaAbAc應(yīng)用：多組分測定第十一頁，共60頁。定量分析(dnglingfnx)方法(1) 標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線法 (2) 標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)溶液對比法(3) 吸光系數(shù)法第十二頁，共60頁。標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線法最經(jīng)典方法前提：固 定 儀 器 和 固 定 條 件(tiojin)

5、 A= K*BC 過程：配置標(biāo)準(zhǔn)溶液系列 分別測定 A 得CA曲線 樣品 測定A樣 查得C樣第十三頁，共60頁。標(biāo)準(zhǔn)溶液對比(dub)法在相同的條件下，配制濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為cx的樣品(yngpn)溶液，在最大吸收波長處，分別測定二者的吸光度值為As、Ax ，依據(jù)朗伯-比爾定律得: As=Kbcs Ax=Kbcx 則: cx = cs*Ax /AssCiCCX第十四頁，共60頁。吸光系數(shù)(xsh)法吸光系數(shù)法又稱絕對法，是直接利用朗伯-比爾定律(dngl)的數(shù)學(xué)表達式AKbc進行計算的定量分析方法。在手冊中查出待測物質(zhì)在最大吸收波長 處的吸光系數(shù) 或 ,并在相同條件下測量樣品溶液的吸

6、光度A，則其濃度為： AcLLEA%1cm1max%1cm1E或第十五頁，共60頁。檢測(jin c)方法1.終點(zhngdin)法 2.固定時間法3.連續(xù)監(jiān)測法 第十六頁，共60頁。 終點(zhngdin)法 終點分析法是基于反應(yīng)達到平衡時反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其對光吸收強度(qingd)的大小，對物質(zhì)進行定量的一類分析方法。反應(yīng)混合物進行一定時間反應(yīng)后，達到平衡終點，即在顯色反應(yīng)處于穩(wěn)定階段時，監(jiān)測其顏色對光的吸收強度(qingd)，以此計算待測物濃度。終點時間的確認(rèn)(qurn)：一、根據(jù)時間-吸光度曲線 如:Trinder（偶聯(lián)終點比色法）反應(yīng)測尿酸，反應(yīng)曲線上3-5分鐘時其A趨向穩(wěn)

7、定,故可將5分鐘作為反應(yīng)終點。二、根據(jù)被測物反應(yīng)終點，結(jié)合干擾物的反應(yīng)情況來確定 如:溴甲酚綠法測血清白蛋白 第十七頁，共60頁。分 類終點法： 一點(y din)終點法 二點終點法 免疫比濁法 雙波長法第十八頁，共60頁。一點(y din)終點法一點終點(zhngdin)法在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時，選擇一個時間點測定吸光度值。通常在反應(yīng)終點(zhngdin)附近連續(xù)讀兩個吸光度，求出兩點的平均值，并根據(jù)兩點的差值判斷反應(yīng)是否達到平衡。第十九頁，共60頁。一點(y din)終點法的設(shè)置：以R和S混合之前的空氣空白、水空白或試劑空白的吸光度值為測定(cdng)計算基點，以反應(yīng)達到平衡

8、的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，校準(zhǔn)曲線通過零點且成直線，對于反應(yīng)速度比較快的實驗多用。 多見于單試劑項目，如：總蛋白，白蛋白等。第二十頁，共60頁。2021-12-121Am T（時間（時間(shjin)）AS+R(吸光度吸光度(gungd)）一點終點(zhngdin)法反應(yīng)曲線 計算公式： C=(Am-Ab)*KAm-終點讀數(shù)點的吸光 Ab-試劑空白吸光度 K-校正系數(shù)第二十一頁，共60頁。TP反應(yīng)(fnyng)曲線蛋白質(zhì)+Cu2+Cu-蛋白質(zhì)絡(luò)合物 550nm處吸收(xshu)峰第二十二頁，共60頁。二點終點(zhngdin)法第二試劑加入以前，選擇某一點讀取吸光度Am，經(jīng)過一定時間后反應(yīng)達終

9、點后測第二個吸光度值A(chǔ)n,利用兩吸光度之差計算結(jié)果。第一點吸光度值由樣本本身或第一試劑與樣品的非特異性反應(yīng)有關(guān)，相當(dāng)于樣品空白，可有效的消除(xioch)樣品自身的吸光度，如溶血，黃疸，脂血等的干擾。第二十三頁，共60頁。AnTAR2AmS+R1(吸光度吸光度(gungd)）（時間（時間(shjin)）兩點終點兩點終點(zhngdin)樣本空白樣本空白=S+R1S+R1+R2（體積校正因子）（體積校正因子）k0 計算公式計算公式 C=(An-K0*Am)*K 第二十四頁，共60頁。CRE反應(yīng)(fnyng)曲線肌酐在一系列酶的作用下生成H2O2，H2O2和4-氨基氨替比林反應(yīng)生成紅色(hngs)

10、醌類物質(zhì)，在540nm處有吸收峰。第二十五頁，共60頁。Mg反應(yīng)(fnyng)曲線在堿性溶液(rngy)中，Mg與二甲苯胺藍(lán)形成重氮鹽類的紫色復(fù)合物，Mg2+濃度可由二甲苯胺藍(lán)吸光度的下降，通過光度測定法來測定。第二十六頁，共60頁。免疫(miny)比濁法 通過物質(zhì)對光(du gung)的散射或透射來測定物質(zhì)含量的 方法： 散射比濁：特定蛋白分析儀 透射比濁：自動生化分析儀 通常作兩點終點法分析，多采用多點校準(zhǔn)。 應(yīng)用：用Ab測定Ag（主要為微量蛋白：IG、 C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab過量，此時Ag-Ab復(fù)合物的生成量隨Ag的增加而遞增，光散/透射強度與抗原量成正比

11、。第二十七頁，共60頁。免疫(miny)比濁法優(yōu)點： 方法簡便 結(jié)果準(zhǔn)確 可用于自動化儀器檢測缺點：抗體用量大 達平衡(pnghng)時間長第二十八頁，共60頁。雙波長(bchng)法 消除樣品中對測定有干擾的物質(zhì)的影響； 在試樣中含有兩個(lin )組分a和b時，若要測定組分b,組分a有干擾，應(yīng)設(shè)法消除組分a的吸收干擾。首先選擇待測組分b的最大吸收波長1作為測量波長，然后用作圖的方法選擇參比波長2 ，使組分a在這兩個(lin )波長處的吸光度相等。 試樣溶液在2和1兩個波長處的吸光度之差，只與待測組分的濃度成正比，而與干擾(gnro)組分的濃度無關(guān)第二十九頁，共60頁。干擾(gnro)物質(zhì)1

12、.脂血：吸收光譜300-600nm呈下降(xijing)趨勢2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm 吸收峰3.膽紅素：300-500nm有吸收峰 可見它們的吸收峰都較寬，且同測定波長有重疊現(xiàn)象。第三十頁，共60頁。雙波長(bchng)法雙波長測定(cdng)優(yōu)點 ： 消除噪音干擾 減少雜散光影響 減少樣品本身光吸收的干擾 第三十一頁，共60頁。固定(gdng)時間法 指在時間-吸光度曲線上選擇兩個(lin )測光點，這兩點既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點吸光度，利用這兩點吸光度差值計算結(jié)果。 如：苦味酸法測肌酐 計算公式： C=(A2-A1)*KA1A2T(吸光度）吸光度）第三十二

13、頁，共60頁。 測定底物的消耗(xioho)或產(chǎn)物生成的速度的化學(xué)方法稱為連續(xù)監(jiān)測法（又稱動態(tài)分析法、速率法或動力學(xué)法）。在反應(yīng)速度恒定期（零級反應(yīng)期）來連續(xù)觀察和記錄一定反應(yīng)時間內(nèi)底物或產(chǎn)物量的變化。通過測定一段時間內(nèi)吸光度的變化速率（ A/min ）來計算待測物的濃度。 酶活性測定如（ALT、AST、ALP、GGT等）常用連續(xù)監(jiān)測連續(xù)監(jiān)測(jin c)法法（速率法）（速率法）第三十三頁，共60頁。酶促反應(yīng)(fnyng)曲線第三十四頁，共60頁。連續(xù)(linx)監(jiān)測法 即零級反應(yīng)速率法,亦稱斜率法 在較長反應(yīng)時間區(qū)段內(nèi)(90-180秒)，每隔一定時間(530秒)讀取一次吸光度(gungd)值

14、，至 少讀取4點，得到3個以上A，最后算出 反應(yīng)速率A/min。uTuuuVVltALU610/第三十五頁，共60頁。第三十六頁，共60頁。酶促反應(yīng)(fnyng)進程曲線第三十七頁，共60頁。2021-12-138A1TAS+R1R2A2(吸光度吸光度(gungd)）（時間（時間(shjin)）連續(xù)連續(xù)(linx)監(jiān)測監(jiān)測法法A/min=(A2-A1 )-(空白空白)/(t2-t1)t2t1第三十八頁，共60頁。連續(xù)監(jiān)測(jin c)法特點 與固定時間法相比，屬于即時觀測，無需停止酶促反應(yīng)、不需添加其他呈色試劑，且可將多點的測定結(jié)果繪圖(hu t)連線，快速、直觀查看酶促反應(yīng)進程，很容易找到呈

15、直線的線性期，檢查到是否偏離零級反應(yīng)。第三十九頁，共60頁。典型(dinxng)酶聯(lián)法反應(yīng)曲線第四十頁，共60頁。ALT反應(yīng)(fnyng)曲線第四十一頁，共60頁。AMY反應(yīng)(fnyng)曲線第四十二頁，共60頁。生化(shn hu)結(jié)果報告審核責(zé)任心不強，未對結(jié)果進行認(rèn)真審核責(zé)任心不強，未對結(jié)果進行認(rèn)真審核對檢測對檢測(jin c)(jin c)儀器或試劑方法學(xué)不夠了解儀器或試劑方法學(xué)不夠了解工作經(jīng)驗不足工作經(jīng)驗不足對儀器檢測對儀器檢測(jin c)(jin c)的結(jié)果及室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果過于相信的結(jié)果及室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果過于相信第四十三頁，共60頁。1.結(jié)合質(zhì)控判斷(pndun)結(jié)果在控在控GLO=T

16、PALB偏高第四十四頁，共60頁。2.結(jié)合(jih)臨床資料審核結(jié)合病人的性別、年齡、臨床診斷結(jié)合病人的性別、年齡、臨床診斷(zhndun)(zhndun)、其他檢查結(jié)、其他檢查結(jié)果審核果審核 例：某病人檢測的例：某病人檢測的TPTP為為110g/L110g/L，該標(biāo)本沒有脂血等影，該標(biāo)本沒有脂血等影響檢測結(jié)果的因素響檢測結(jié)果的因素 臨床診斷臨床診斷(zhndun)(zhndun)：多發(fā)性骨髓瘤：多發(fā)性骨髓瘤 另：胰島素與低血糖、病人輸注藥物對結(jié)果的影響另：胰島素與低血糖、病人輸注藥物對結(jié)果的影響第四十五頁，共60頁。檢驗(jinyn)項目間的內(nèi)在聯(lián)系各檢測參數(shù)間存在各檢測參數(shù)間存在(cnzi

17、)(cnzi)大小、比例、邏輯關(guān)系大小、比例、邏輯關(guān)系例：例：TC HDL-C+LDL-CTC HDL-C+LDL-C、 TBI DBI TBI DBI CK CK-MB CK CK-MB LDH-HBDH LDH-HBDH第四十六頁，共60頁。影響檢驗結(jié)果(ji gu)(ji gu)的因素 試劑(shj)線性范圍： 了解檢驗項目試劑(shj)的線性范圍，對超過或低于范圍的項目，必須進行相應(yīng)的減量稀釋或增量后重新測定。第四十七頁，共60頁。線性范圍(fnwi) 在實際工作中，用連續(xù)監(jiān)測在實際工作中，用連續(xù)監(jiān)測(jin c)(jin c)法會法會遇到檢驗結(jié)果為遇到檢驗結(jié)果為0 0或者負(fù)值的情況，

18、此時不能盲或者負(fù)值的情況，此時不能盲目相信該結(jié)果低就出具低值報告，應(yīng)查看其反目相信該結(jié)果低就出具低值報告，應(yīng)查看其反應(yīng)曲線應(yīng)曲線例：某病人的尿液例：某病人的尿液AMYAMY檢測結(jié)果為檢測結(jié)果為0U/L0U/L 其反應(yīng)曲線如下圖：其反應(yīng)曲線如下圖：第四十八頁，共60頁。AMY反應(yīng)(fnyng)曲線第四十九頁，共60頁。AMY反應(yīng)曲線(qxin)分析分析：由于測定物質(zhì)分析：由于測定物質(zhì)(wzh)(wzh)濃度過高濃度過高處理：對測定物質(zhì)處理：對測定物質(zhì)(wzh)(wzh)進行十倍左右的稀釋再測進行十倍左右的稀釋再測定，直到反應(yīng)曲線恢復(fù)正常結(jié)果才可靠定，直到反應(yīng)曲線恢復(fù)正常結(jié)果才可靠第五十頁，共60

19、頁。AMY反應(yīng)(fnyng)曲線第五十一頁，共60頁。AMY反應(yīng)(fnyng)曲線第一次稀釋(xsh)后第五十二頁，共60頁。檢測(jin c)項目的方法學(xué) 分析：分析：CKCK是由是由M M和和B B兩類亞基組成兩類亞基組成(z (z chn)chn)的二聚體，其構(gòu)成為的二聚體，其構(gòu)成為CK-MB(CK-MB(心型心型) )約占約占0-0-3%3%、 CK-MM( CK-MM(肌型肌型) )約占約占97-100%97-100%、 CK-BB CK-BB（腦型）（腦型）約占約占0-1%0-1% 第五十三頁，共60頁。影響(yngxing)檢驗結(jié)果的因素 檢測項目的方法學(xué)：檢測項目的方法學(xué)： 要

20、了解該項目試劑采用的方法學(xué)：要了解該項目試劑采用的方法學(xué)： 例：某病人在測定心肌酶譜時，其例：某病人在測定心肌酶譜時，其CK:246U/LCK:246U/L、CK-MB:286U/LCK-MB:286U/L，標(biāo)本，標(biāo)本(biobn)(biobn)無溶血等因素影無溶血等因素影響響, ,其結(jié)果中其結(jié)果中CK-MBCK-MBCKCK第五十四頁，共60頁。CK-MBCK-MB采用的檢測采用的檢測(jin c)(jin c)方法為免疫抑制法方法為免疫抑制法 正常人體中，正常人體中，CKCK同工酶中同工酶中CK-MMCK-MMCK-MBCK-MBCK-BB,CK-BB,其中其中CK-CK-BBBB含量極少

21、，可忽略。免疫抑制法正是建立于忽略含量極少，可忽略。免疫抑制法正是建立于忽略CK-BBCK-BB的基礎(chǔ)上。采用抗體抑制其的基礎(chǔ)上。采用抗體抑制其M M亞基活性，使亞基活性，使CK-MMCK-MM失去活失去活性，而性，而CK-MBCK-MB失去一半的活性。單測定失去一半的活性。單測定B B亞基的活性，其亞基的活性，其結(jié)果結(jié)果2 2即為即為CK-MBCK-MB活性?；钚?。由于在患輕度或中度腦損傷、腦血管意外及腦手術(shù)后由于在患輕度或中度腦損傷、腦血管意外及腦手術(shù)后 造造成腦組織發(fā)生實質(zhì)性損害成腦組織發(fā)生實質(zhì)性損害(snhi)的病人中，的病人中，CK-BB會會升高，這時該方法測定的升高，這時該方法測定的CK-MB的活性相當(dāng)于是的活性相當(dāng)于是CK-MB+2CK-BB的活性之和，造成的活性之和，造成CK-MB活性假性升高。活性假性升高。第五十五頁，共60頁。檢驗標(biāo)本(biobn)的影響 標(biāo)本脂血會使反應(yīng)濁度標(biāo)本脂血會使反應(yīng)濁度(zhu d)(zhu d)增加，透光增加，透光度下降，吸光度增加，從而造成檢驗結(jié)果不準(zhǔn)度下降，吸光度增加，從而造成檢驗結(jié)果不準(zhǔn)確。如確。如TPTP、TGTG、UAUA顯著增高，顯著增高，GGTGGT顯著下降或為顯著下降或為0 0 標(biāo)本溶血會使標(biāo)本溶血會使K+K+、ALTALT、ASTAST、LDHLDH等檢驗結(jié)果等檢驗結(jié)果顯著升高顯著升高抗