引物設(shè)計(jì)原則7頁(yè)

1、設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。引物分析軟件將試圖通過(guò)使用每一引物設(shè)計(jì)變化的預(yù)定值在這兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡。設(shè)計(jì)引用有一些需要注意的基本原理：引物設(shè)計(jì)有3 條基本原則: 首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)。 其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配) 。具體實(shí)現(xiàn)這3 條基本原則需要考慮到諸多因素,如引物長(zhǎng)度(primer length) , 產(chǎn)物長(zhǎng)度(productlength) ,序列Tm 值(melting temperature) ,引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability

2、 ,用G值反映) ,形成引物二聚體(primer dimer) 及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(du2plex formation and hairpin) 的能值,在錯(cuò)配位點(diǎn)(falsepriming site) 的引發(fā)效率, 引物及產(chǎn)物的GC 含量(composition) ,等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾,如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),引進(jìn)突變等。 引物長(zhǎng)度和產(chǎn)物長(zhǎng)度一般引物長(zhǎng)度為1830堿基。產(chǎn)物長(zhǎng)度以200bp500bp為宜?？偟恼f(shuō)來(lái)，決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長(zhǎng)度。有以下公式可以用于粗略計(jì)算引物的退火溫度。在引物長(zhǎng)度小于20bp時(shí)：4(G+C)+2(A+T)-5在引物長(zhǎng)度大于20bp時(shí)

3、：62.3+0.41(%G-C)-500/length-5為了優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保退火溫度不低于54的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。總的說(shuō)來(lái)，每增加一個(gè)核苷酸引物特異性提高4倍，這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。引物長(zhǎng)度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。由于熵的原因，引物越長(zhǎng)，它退火結(jié)合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。 GC含量一般引物序列中G+C含量一般為40%60%，一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5端加適量的A、T或G、C尾巴。 退火溫度退火溫度需要比解鏈溫度低5，如果引物堿基數(shù)較少

4、，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，是DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差46不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的，可以在5575間變化。 避免擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)目的片段的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。 與靶DNA的錯(cuò)配當(dāng)被擴(kuò)增的靶DNA序列較大的時(shí)候，一個(gè)引物就有可能

5、與靶DNA的多個(gè)地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個(gè)條帶出現(xiàn)。這個(gè)時(shí)候有必要先使用BLAST軟件進(jìn)行檢測(cè)，網(wǎng)址：/BLAST/。選擇Align two sequences (bl2seq)，如下圖。 引物末端引物3端是延伸開(kāi)始的地方，因此要防止錯(cuò)配就從這里開(kāi)始。3端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。3端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3端不能發(fā)生錯(cuò)配。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。 引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)引物自身不

6、應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。兩引物之間不應(yīng)該存在互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 為了下一步操作而產(chǎn)生的不完全匹配5端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。額外的堿基或多或少會(huì)影響擴(kuò)增的效率，還加大引物二聚體形成的幾率，但是為了

7、下一步的操作就要作出適當(dāng)?shù)摹盃奚?。很多時(shí)候PCR只是初步克隆，之后我們還需要將目的片段亞克隆到各種載體上，那么就需要在PCR這個(gè)步驟為下一步的操作設(shè)計(jì)額外的堿基。以下總結(jié)一些為了亞克隆所要設(shè)計(jì)的序列。 a 添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)添加酶切位點(diǎn)是將PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆使用得最多的手段。一般酶切位點(diǎn)是六個(gè)堿基，另外在酶切位點(diǎn)的5端還需要加23個(gè)保護(hù)堿基。但是不同的酶需要的保護(hù)堿基數(shù)目是不相同的，例如：Sal不需要保護(hù)堿基，EcoR需要1個(gè)，Not需要2個(gè)，Hind 3個(gè)。其中，在原核表達(dá)設(shè)計(jì)引物時(shí)還有一些小技巧，大家可以參考：原核表達(dá)之實(shí)驗(yàn)前的分析。里面一些規(guī)則是所有表達(dá)都通用的。&#

8、160;有一種做法是在進(jìn)行PCR反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行酶切，這樣就需要注意一些內(nèi)切酶在PCR反應(yīng)中的酶切反應(yīng)率，見(jiàn)附錄。不過(guò)這種方法雖然方便但并不推薦。有時(shí)候，就是把PCR產(chǎn)物回收后酶切再與載體連接效果都不盡理想，同步進(jìn)行會(huì)使出現(xiàn)問(wèn)題的原因變得更加復(fù)雜。一旦出現(xiàn)問(wèn)題，分析起來(lái)更麻煩。b LIC添加尾巴LIC的全稱是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司專門(mén)為其部分的pET載體而發(fā)明的一種克隆方法。用LIC 法制備的pET 載體有不互補(bǔ)的1215 堿基單鏈粘端，與目的插入片段上相應(yīng)粘端互補(bǔ)。擴(kuò)增目的插入片段的引物5'序列要與LIC載體互補(bǔ)。T4 DNA

9、聚合酶的3'5'外切活性經(jīng)短時(shí)間即可在插入片段上形成單鏈粘端。由于只能由制備好的插入片段和載體互相退火形成產(chǎn)物，這種方法非?？焖俑咝В覟槎ㄏ蚩寺?。 c 定向TA克隆添加尾巴在T載體剛出的時(shí)候大家都拍手稱贊，真是方便，哪個(gè)小子腦子這么聰明想出來(lái)的。但是后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)TA克隆無(wú)法將片段定向克隆到載體中，所以后來(lái)Invitrogen推出了可以定向克隆的載體，它的一端含有四個(gè)突出的堿基GTGG。因此在PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)也要相應(yīng)的加上與之互補(bǔ)的序列，這樣片段就可以“有方向”了。 d In-Fusion克隆方法這項(xiàng)技術(shù)是Clontech還屬于BD的時(shí)候推出的，2004年

10、在生物通可著實(shí)風(fēng)光了一把，不但當(dāng)選年度創(chuàng)新試劑還被大家投票為最受大家歡迎的試劑。此技術(shù)就其步驟來(lái)說(shuō)是及其方便的，不需連接酶，不需長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)。只要在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候引入一段線性化載體兩端的序列，然后將PCR產(chǎn)物和線性化的載體加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室溫下放置半個(gè)小時(shí)就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化了。這種方法特別適合大批量的轉(zhuǎn)化。引物設(shè)計(jì)原則引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。 在PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，目的基因

11、DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，如此重復(fù)循環(huán)，延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合。 PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。 1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。

12、 2.引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。引物長(zhǎng)度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。預(yù)期產(chǎn)物的特定長(zhǎng)度經(jīng)常取決于應(yīng)用的需要。若目的是建立測(cè)定特異DNA片段的臨床檢驗(yàn)方法，120300bp的小DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可能是最好的。產(chǎn)物應(yīng)具有好的特異性和高的產(chǎn)生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實(shí)驗(yàn)的足夠信息。這一長(zhǎng)度范圍的產(chǎn)物可以通過(guò)采用兩步擴(kuò)增循環(huán)方法得到，從而減少擴(kuò)增時(shí)間。 其他PCR方法有不同的最佳產(chǎn)物長(zhǎng)度。例如，通過(guò)定量的RNA-PCR檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物應(yīng)該足夠大以便構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)性模板，這樣，產(chǎn)物和

13、競(jìng)爭(zhēng)物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來(lái)。這些產(chǎn)物一般在250750bp范圍內(nèi)。 3.引物GC含量在40%60%間，Tm值最好近72GC含量（composition）過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。 4.引物3端要避開(kāi)密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼

14、子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。 5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。引物3端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T(mén)時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。 6. 堿基要隨機(jī)分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G

15、C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。 7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3 端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其G值不要過(guò)高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。 8. 5 端和中間G值應(yīng)相對(duì)較高

16、3 端較低G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5 端和中間G值相對(duì)較高，而3 端G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9）的引物。引物3 端的G 值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進(jìn)行分析） 9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。引物的5 端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等

17、。 引物的延伸是從3 端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。3 端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。 10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。某些引物無(wú)效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G°）小于58.6l kJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。 11. 引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)

18、行下一步的實(shí)驗(yàn)了。 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 做Real Time時(shí),用于SYBR Green I法時(shí)的一對(duì)引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計(jì)的要求： 避免重復(fù)堿基，尤其是G. Tm=58-60度。 GC=30-80%. 3'端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C. 正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度： 引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150 bp最為合適（可以延長(zhǎng)至300 bp）。 引物的退火溫度要高，一般要在60度以上； 要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。 而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮