啤酒酵母的蔗糖酶的提取提純及測定

1、浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)論文 2013 年12 月 13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提純及測定研究論文摘要：為了了解蔗糖酶的性質(zhì)，我們用啤酒酵母做了一系列的實(shí)驗(yàn)，它們主要是以下內(nèi)容：（1），蔗糖酶的提取與初提純：a、先將酵母自溶，再兩次離心得初提液A；b、接著調(diào)PH并加熱、離心得熱提取液B；c、用乙醇沉淀離心得提取液C。（2），蔗糖酶的純化Q Sepharose 柱沉析法：先裝柱，再安裝鹽度梯度發(fā)生器與柱的平衡，接著加樣并洗脫，最后處理結(jié)果與交換劑的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的測定：第一人做葡萄糖標(biāo)曲，第二人測定各提取液反應(yīng)后的OD540值，得各提取液的酶活力與回收率。（4），蔗

2、糖酶蛋白質(zhì)含量的測定及活力計(jì)算：遇上一個實(shí)驗(yàn)相反，第二人做標(biāo)曲，第一個人測與各提取液相對應(yīng)的OD660值，再對比得到各提取液的總蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率與純化倍數(shù)。(5),微量凱氏定氮法（以B為樣品）：先將樣品B消化得消化液，洗滌定氮儀，再將消化液蒸餾，用HCl滴定餾出液，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。（6），SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量：首先制備分離膠并使之凝固，再制備濃縮膠使之在分離膠之上凝固，加處理后的樣品和標(biāo)準(zhǔn)液，接著電泳，最后染色和脫色，確定樣品相對分子質(zhì)量。關(guān)鍵詞：蔗糖酶；蛋白質(zhì)；提??；純化；酶活力測定；Folin-酚試劑；微量凱式定氮；SDS-聚丙烯胺凝膠;標(biāo)曲；電泳；

3、正文：文獻(xiàn)綜述蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又稱轉(zhuǎn)化酶(Invertase)，可作用于21,2糖苷鍵,將蔗糖水解為D2葡萄糖和D2果糖 ，廣泛存在于動植物和微生物中，主要從酵母中得到。蔗糖酶的最適溫度為45-50，最適ph為4.0-4.5. 實(shí)驗(yàn)原理、試劑與器材、操作方法、結(jié)果與分析、注意事項(xiàng)、認(rèn)識與體會1 蔗糖酶的提取及初步提純1.1實(shí)驗(yàn)原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶屬于胞內(nèi)酶，所以常將細(xì)胞壁破碎后進(jìn)行提取。酶的生產(chǎn)方法有生物提取法、微生物發(fā)酵法及化學(xué)合成法，細(xì)胞破碎又有化學(xué)裂解法、低滲溶液法等，本法屬于生物提取法、菌體自溶的方法。經(jīng)破碎提取的蔗糖酶液再經(jīng)熱提取、乙醇沉淀提

4、取，使蔗糖酶得到初步的提純。1.2 試劑與器材1.2.1試劑 啤酒酵母；醋酸鈉（AR）；甲苯（AR）；4mol/L醋酸；95%乙醇（<-20）；0.5mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液。稱取121.1g Tris溶于1500ml的蒸餾水中，用4 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.3（HCl量約為230ml），用蒸餾水稀釋到2L，即為0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液。0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液：將0.5mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液稀釋10倍即得。注：整個實(shí)驗(yàn)要注意避免高溫，以防止酶失活。1.2.2器材 錐形瓶2

5、50ml（×1），50ml（×1）；量筒10ml（×1）25ml（×1）;燒杯100 ml（×1），1000 ml（×1）；具塞試管10 ml（×3）；吸球、玻棒、滴管、pH試紙；培養(yǎng)箱；恒溫水浴箱；磁力攪拌器，攪拌子；高速冷凍離心機(jī)。1.3操作方法 1 酵母的自溶 ：在弱堿中培養(yǎng)60小時(shí)； 2 初提取液A：取出酵母自溶液體，經(jīng)兩次離心得初提液A； 3 熱提取液B：水浴提取液A，并使PH為4.5，離心得熱提取液B4 乙醇沉淀提取液C：將B冷卻并加入乙醇持續(xù)攪拌，不少于30min，離心得提取液C1.4結(jié)果與分析1.4.1結(jié)果表

6、2-1提取液顏色狀態(tài)體積（ml）A黃色液體17.0B淺黃色液體18.0C淡黃色液體8.27 VA總=VA=17.0ml VB總=VB·VA/(VA-3)=18.0ml VC總=Vc·VA/(VA-3) ·VB/(VB-3)=Vc·VB總/(VB-3)=8.27ml 1.4.2分析 提取液A、B、C顏色不斷便簽是因?yàn)殡s質(zhì)不斷消除。這次的數(shù)據(jù)與其他小組無太大差距，這不會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.4.3結(jié)論VA總=17.0ml ； VB總=218.0ml ； VC總=8.27ml。1.5注意事項(xiàng)第一次離心后取液體時(shí)要小心；水浴時(shí)的溫度不要超過50。同時(shí)在保溫過程中不斷

7、搖動錐形瓶。冰浴時(shí)要迅速操作；冰浴操作過程中慢慢加入緩沖液并攪拌使固體充分溶解，減少損失；1.6認(rèn)識與體會 實(shí)驗(yàn)操作無明顯錯誤，操作仍能精確，但需鍛煉；離心操作前需平衡，否則會損壞離心機(jī)；蔗糖酶在50°C以上失活。2 蔗糖酶的純化Q Sepharose-柱層析法2.1實(shí)驗(yàn)原理離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以一定pH和離子強(qiáng)度的溶液為流動相，流動相和固定相之間發(fā)生可逆的離子交換反應(yīng)，利用離子交換劑對需要分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。由于各種蛋白質(zhì)所帶電荷的種類和數(shù)量不同，它們被吸引的程度也不同。當(dāng)被吸附的蛋白質(zhì)的Kd值有差異時(shí)，降低pH值或提

8、高離子強(qiáng)度均可使之洗脫下來，用含陰離子（如Cl-)的溶液洗柱，含電荷少的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來，增加Cl-濃度，含電荷多的蛋白質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。2.2試劑與器材2.2.2.1試劑 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液；1mol/LNaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液；0.5mol/LNaOH；Q Sepharose，長期保存需置于20%乙醇中，4保存。注：整個實(shí)驗(yàn)要注意避免高溫，以防止酶失活。2.2.2.2器材 層析柱；梯度混合器

9、;磁力攪拌器，攪拌子；紫外分光光度計(jì)；點(diǎn)滴板；尿糖試紙、擦鏡紙；止水夾；燒杯、試管。 2.3操作方法 1離子交換柱的填充：將層析柱垂直固定，加水，排除氣泡，再加少量水，裝入離子交換劑，至柱高5cm，交換柱上端保留少許水（不得干柱）。 2緩沖液鹽度梯度發(fā)生器的安裝：在低濃度一段裝入攪拌子。且要形成梯度。3柱的平衡：將柱子與恒流泵連通，用25ml Tris-HCl pH7.3緩沖液進(jìn)行沖洗平衡完成后，交換劑上方需保留5ml左右的緩沖液。4加樣：緩慢加樣，不能把柱面沖到導(dǎo)致柱面不平，這是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵之一5洗脫：為防止液面低于交換劑表面，加入了5ml緩沖液。6測OD值：在紫外分光計(jì)光度計(jì)上測出每管在

10、280nm處的紫外吸光度OD值。得到各管的OD值如下： 表2-2試管號OD280值試管號OD280值10.322140.120 20.447150.109 30.060160.083 40.054170.077 50.065 180.069 60.031190.126 70.028 200.30580.016 210.900 90.037 221.014100.048 230.673 110.061 240.281120.231 25130130.2847酶活力測試用葡萄糖測驗(yàn)試紙測試每管內(nèi)蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取1、2、5、12、13、14、20、21、22、23管進(jìn)行測試。 酶活

11、力測試方法：在點(diǎn)滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待測洗脫液，用玻璃棒攪勻，放置5min，浸入葡萄糖試紙，1s后取出，60s比較顏色深淺。將其合并成一管，VD=5.22ml2.4結(jié)果與分析2.4.1結(jié)果 VD =5.22ml VD總=VD·VC總/V樣=5.6×6.1/0.5=86.34ml。由數(shù)據(jù)得表如下： 圖2-1 Q Sepharose-柱層析法提純酶數(shù)據(jù)處理表2.4.2分析 柱的高度與沖洗的流速、梅的濃度及柱的帶電量大小會影響樣品在柱內(nèi)的移動快慢； 酶活力不是特別的強(qiáng)，也許是前面柱下端滲出液體導(dǎo)致蔗糖酶流失； 適當(dāng)增加柱的高度與降低沖洗液的流速能提高分離效率； 在使用Q

12、-Sepharose純化方法之前還有過DEAE-纖維素層析方法和DEAE Sepharose層析方法，但比較這幾種方法，用Q-Sepharose純化方法有如下特點(diǎn)： (1) 提高實(shí)驗(yàn)效果。瓊脂糖凝膠離子交換介質(zhì)比纖維素介質(zhì)載量高,分離純化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。蔗糖酶與雜蛋白得到了很好的分離,提高純度,真正體現(xiàn)離子交換色譜蛋白質(zhì)純化上的優(yōu)越性,增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的意義。（2） 縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。梯度洗脫時(shí)間由原來的100min縮短到現(xiàn)在的50min,減少不必要的實(shí)驗(yàn)重復(fù),實(shí)驗(yàn)過程比較緊湊。（3） 節(jié)約實(shí)驗(yàn)支出。離子交換介質(zhì)DEAE-纖維素由于流速慢,柱床高度會隨緩沖液濃度及pH改變,不能承受0.

13、1M以上NaOH清洗,重生效果差,壽命短。瓊脂糖介質(zhì)在分辨率、回收率、流速等具有優(yōu)越性。且其化學(xué)穩(wěn)定性極高,不易破碎,可以承受1MNaOH的清洗,重生效果好,可以使用數(shù)百至上千次,因而降低了成本。2.4.3結(jié)論VD 5.22mlVD總 =86.34ml。2.5注意事項(xiàng)在整個柱操作過程中，要嚴(yán)格防止液面低于交換劑的表面。當(dāng)液面低 于交換劑表面時(shí)，空氣進(jìn)入交換劑內(nèi)，形成氣泡，而影響分離效果；加樣不可太快，以免攪渾交換劑的表面，而使分離不純；恒流泵的流速要控制好，要速度有利于液體滴下來，同時(shí)防止液體下滴過快而引起干柱。是絕對不能干柱；鹽度梯度發(fā)生器內(nèi)氣泡要除盡；2.6認(rèn)識與體會在本實(shí)驗(yàn)中，由于操作失

14、誤，導(dǎo)致柱內(nèi)氣壓太大，加樣時(shí)在柱的下端有液體流出，影響了本實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，使得D的酶濃度不高，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，提純也不好。 3 蔗糖酶活力的測定3.1實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)用DNS法測還原糖的含量，進(jìn)而計(jì)算酶的活力。蔗糖水解產(chǎn)生的葡萄糖和果糖均是還原性糖，可以在氫氧化鈉和丙三醇的作用下與2,3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)，生成的棕紅色氨基化合物在540nm波長處有最大吸收。在一定范圍內(nèi)還原糖的量與其吸光值呈線性關(guān)系，于是做出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以后，就可以利用比色法可測出樣品中的還原糖含量。酶活力是指某種酶在最適PH、溫度等條件下催化底物水解的能力，通常以一段時(shí)間后底物的減少量或產(chǎn)物的生成量多少來表示。酶活力單位數(shù)（

15、U）：在一定條件下，3min內(nèi)能水解蔗糖成還原糖1mg所需的酶量，稱為1個活力單位數(shù)?？偦盍挝粩?shù)=（V測體積測出的葡萄糖克數(shù)/V測）*(試管溶液總體積/2)*V總*nV總為各種提取液在提取過程中的總體積。酶回收率=（各提取液的總酶活/處提取液A的總酶活）*100%3.2試劑與器材3.2.1試劑3,5-二硝基水楊酸（1）甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.0ml10%氫氧化鈉溶液中并用水稀釋至69ml，在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。（2）乙液：稱取255g酒石酸鉀鈉加到330ml10%氫氧化鈉溶液中，再加入880ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液。將甲乙二溶液混合即得黃色試劑，貯于棕色瓶中備用，在

16、室溫放置710天后使用。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2mg/ml） 準(zhǔn)確稱取20mg分析純葡萄糖（預(yù)先在105干燥至恒重），用少量蒸餾水溶解后，定量移入100ml的容量瓶中，定容。5%蔗糖、；0.2mol/L pH4.6醋酸緩沖液 溶解10.83g醋酸鈉于水中，加近260ml的1 mol/L醋酸調(diào)pH到4.6，稀釋至2L； 5%蔗糖 用0.2mol/L pH4.6醋酸緩沖液配置； 2mol/L NaOH 溶解0.80g氫氧化鈉于10ml水中。3.2.2器材 電爐；恒溫水浴;紫外分光光度計(jì)；試管、吸管；3.3操作方法 1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取6支試管，分別按表3-1加入各種試劑。將各管內(nèi)液體混合均勻，

17、在沸水浴加熱5min。取出后立即用冷水冷卻到室溫，于540nm波長處測OD值，以葡萄糖的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2-3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試管號012345葡萄糖00.801.001.201.401.60蒸餾水3.002.202.001.801.601.40DNS1.501.501.501.501.501.50總體積4.504.504.504.504.504.50OD0.0000.2340.4060.5570.7460.9142酶活力測定將前個實(shí)驗(yàn)所得四部分提取液用冷蒸餾水按比例稀釋：初提取液A（1：200）；熱提取液B(1:200)；乙醇提取液C（1：200）；柱分

18、離液D（1：20）。取8支試管，按表3-2加入各種試劑。表2-4 酶的催化反應(yīng)項(xiàng)目A（1：200）B(1:200)C（1：200）D（1：20）加樣A對A樣B對B樣C對C樣D對D樣酶液/ml2.002.002.002.002.002.002.002.002N NaOH0.500.500.500.5035預(yù)熱10min，同時(shí)預(yù)熱5%蔗糖5%蔗糖2.002.002.002.002.002.002.002.00立即搖勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)3min2N NaOH0.500.50.500.50總體積/ml4.504.504.504.54.504.504.504.50取反應(yīng)液A 0.15ml，B 0.25ml

19、，C 0.10ml，D 0.90ml進(jìn)行DNS反應(yīng)，測定540nm處OD值。得到ODA=0.348 ODB=0.288 ODC=0.456 ODD=0.5083.4結(jié)果與分析3.4.1結(jié)果 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖2-2總活力單位數(shù)=mg/V測·4.5/2·V總·n酶的回收率=（各提取液的總酶活/初提取液A的總酶活）·100%本次試驗(yàn)最終結(jié)果：表2-5項(xiàng)目初提液A熱提取液B乙醇提取液C柱分離液DV測/ml0.150.250.100.90mg0.1870.1730.2130.225V總/ml17.119.49.097.8總活力單位數(shù)/U9613.626051

20、.648618.401100.25回收率/%10062.9589.6511.443.4.2分析（1）、理論中A、B、C、D的回收率應(yīng)該是越來越低的，但這里確實(shí)C>B，可能是因?yàn)镃中蔗糖酶濃度高于B或反應(yīng)時(shí)間控制不好；（2）、蔗糖酶標(biāo)曲在01.-0.7之間呈線性關(guān)系，低于01或高出0.7都要重新做過；.3.5注意做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，加完各種試劑后要充分搖勻。要求測得的OD值在0.10.7測定酶活力時(shí)，要準(zhǔn)確反應(yīng)3min，這個反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該精確把握，不要多1秒也不要少1秒測得在線性范圍外的OD值，需重新配液顯色反應(yīng)。由于某些原因我們這一組用的是另一組的試劑，所以數(shù)據(jù)不符合前面的實(shí)驗(yàn)；3.6認(rèn)識

21、與體會 （1）、還原糖的測定方法有菲林試劑熱滴法、3,5-二硝基水楊酸法、nelson試劑法； （2）、在這種定量且精確地實(shí)驗(yàn)中要嚴(yán)格控制一些因素，比如在這個實(shí)驗(yàn)中必須嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間； 4 蔗糖酶的蛋白質(zhì)含量測定及比活力計(jì)算4.1實(shí)驗(yàn)原理比活力是指單位質(zhì)量（mg）蛋白質(zhì)中酶的含量（U），常用來表示酶的純度。比活力=酶的含量（U）/蛋白質(zhì)含量（mg）測定蛋白質(zhì)含量的方法有福林-酚試劑法、微量凱式定氮法、紫外吸收法、考馬斯亮法等，本實(shí)驗(yàn)采用的是福林-酚試劑法，或稱Lowry法，蛋白質(zhì)與Folin-酚A試劑（堿性）在堿性條件下形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后加入Folin-酚B（酸性），銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物

22、將其還原形成深藍(lán)色鉬藍(lán)和鎢藍(lán)化合物。因?yàn)镕olin-酚B中的磷鉬酸-磷鎢酸可被蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸還原生成藍(lán)色化合物。蛋白質(zhì)濃度增高，產(chǎn)物顏色加深，這一藍(lán)色溶液在750nm和660nm有較強(qiáng)的吸光值。故可用比色法測定已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的OD值，然后據(jù)此測出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度5。4.2試劑與器材4.2.1 試劑試劑A（堿性銅試劑） 取Na2CO3（AR）10g和 NaOH（AR）2g，加蒸餾水30ml，微熱溶解：另取酒石酸鈉 （Na2C2H3O32H2O，AR）0.1g和CuSO45H2O（AR）0.05g，再加入30ml蒸餾水微熱溶解，冷卻后將上述兩溶液混合，再用水稀釋至100

23、ml，即為試劑A。該試劑為含10% Na2CO3，0.1%酒石酸鈉和0.05%硫酸銅的0.5mol/L NaOH溶液。保存于塑料試劑瓶中，24至少可使用1個月。溶解于500毫升蒸餾水中。；試劑B（酚試劑） 在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na2WO42H2O）,25克鉬酸鈉（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫 酸 鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升

24、，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1mol/L左右。標(biāo)準(zhǔn)濃度牛血清白蛋白溶液（200g/ml） 精確稱取結(jié)晶牛血清蛋白或酪蛋白，必要時(shí)預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度精確稱重配成。牛血清白蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%NaCl溶液。；4.2.2器材分光光度計(jì)（使用直徑為10nm的比色皿）；刻度吸管0.5ml（×1），2ml（×1），5ml（×1）;試管1.5 cm×15cm（×8）；具塞試管10 ml（×3）； 恒溫水浴箱（55）；4.3

25、操作方法 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 表2-6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置加樣表管號012345BSA00.20.40.60.81.0水4.54.34.13.93.73.5試劑A1.01.01.01.01.01.0靜置10min（立即充分混勻）試劑B0.30.30.30.30.30.3靜置10min（立即充分混勻）試劑B0.20.20.20.20.20.2混勻55水域5min,測A660OD6600.0000.2370.2160.3440.4810.6230.739由于在振蕩時(shí)，管1有灑出，因此做了兩次。2.未知蛋白濃度的測定按A（1：100）、B（1：100）、C（1：20）、D（不稀釋）進(jìn)行稀釋，A稀釋液去0.

26、4ml，B、C、D稀釋液各取5ml測定OD660(所得數(shù)據(jù)如上表所示)。 【注意】Folin-酚B試劑在酸性條件下穩(wěn)定，而Folin-酚A試劑在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。當(dāng)Folin-酚B試劑加入后，應(yīng)迅速搖勻（加一管，搖一管），使還原反應(yīng)產(chǎn)生在試劑被破壞之前。4.4結(jié)果與分析4.4.1結(jié)果表2-7實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)記錄表標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白（ml)標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白(g)OD6600.2400.216/0.2370.4800.3440.61200.4810.81600.62312000.739樣品A1B1C1D1OD6600.3900.2760.3470.118（?。?圖 2-3表2-

27、8實(shí)驗(yàn)處理結(jié)果總匯表總體積/ml總酶活/u總蛋白/mg比活力/u/mg蛋白回收率/%酶活回收率/%純化倍數(shù)/倍初提取液A17.09613.62316.2030.401001001.00熱提取液B18.06051.64210.2428.7866.4962.950.95乙醇提取液C8.278618.4016.53521.385.2389.6517.15柱分離液D86.341100.250.373014.360.1211.4499.16 4.4.2分析（1）、此次方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，靈敏度高；缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)濃度和光密度線性關(guān)系不夠嚴(yán)格，而且不同的蛋白質(zhì)會因Tyr和Trp的含量不同，造成顯色程度有差異

28、；（2）、此實(shí)驗(yàn)中由于蔗糖酶不斷提純，雖然也不斷損失，但比活力還是應(yīng)該上升的，但這次實(shí)驗(yàn)中比活力A>B，是因?yàn)樯洗螌?shí)驗(yàn)我們組的酶活力沒測，這次用的是上次做的那個組的酶活力；（3）、測D的OD值時(shí)是0.118，不在線性范圍內(nèi)，但由于D試劑不夠用，不重做，本來應(yīng)該將D的取樣量提高重做；4.5注意試劑A加完后，立即充分混勻，靜置10min。再向各管加B后放置10min，再加第二次。 每次加A、B后應(yīng)立即迅速充分混合。4.6認(rèn)識與體會 （1）、folin-酚法之所以比雙縮尿試劑法靈敏是因?yàn)榇朔@色原理與后者相同，只是加入了第二種試劑-folin-酚B試劑，以此增加顯色量，從而提高了靈敏度； （2

29、）、做實(shí)驗(yàn)時(shí)要謹(jǐn)慎仔細(xì)，盡量避免不必要誤差，在本實(shí)驗(yàn)中，我在振蕩試管時(shí)有時(shí)會將溶液振出，雖然量不多，但由于此法靈敏度高也會造成相當(dāng)?shù)恼`差，在振蕩方面仍需練習(xí)；5微量凱氏測總蛋白5.1實(shí)驗(yàn)原理 凱氏定氮法由Kieldahl于1833年首創(chuàng)，是一種元素分析方法。根據(jù)取樣量分類，可以分為常量和微量。 而不同蛋白質(zhì)中含氮量平均16%，凱式定氮儀測定含氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.25，得到蛋白質(zhì)含量。N / 16% = N × 6.25 = 蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)共需消化、蒸餾、滴定3個步驟，其中消化是為了將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮 ，然后在堿性條件下蒸餾，讓無機(jī)氮轉(zhuǎn)化成氨氣出來，用硼酸試劑吸收，最后用

30、鹽酸滴定。滴定指示劑在堿性條件下是綠色，當(dāng)溶液由綠色-灰色-紅色時(shí)可認(rèn)為是滴定完全。 NH2CH2COOH + H2SO4 2 CO2 + 3 SO2 + H2O + NH3 2 NH3 + H2 SO4 （NH4）2 SO4 （NH4）2 SO4 + Na OH Na 2 SO4 + 2 H2O + 2 NH3 2 NH3 + 4 H3BO3 （NH4）2B4O7 + 5H2O （NH4）2B4 O7 + 2 HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO35.2試劑與儀器2.5.2.1試劑 蛋白樣品：2g牛血清白蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀釋至100ml；濃硫酸；硫酸鉀3份與硫酸銅

31、1份（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）混合研磨成粉末；30%NaOH溶液:30g氫氧化鈉溶于蒸餾水，稀釋至100ml； 2%硼酸溶液：2 g溶于蒸餾水，稀釋至100ml； 混合指示劑：01甲基紅酒精溶液和 01甲基藍(lán)酒精溶液臨時(shí)按2:1的比例混合?；?1甲基紅酒精溶液和 01溴甲酚綠酒精溶液臨時(shí)按1:5的比例混合5.2.2器材 改良式凱氏定氮儀；克氏燒瓶50ml（×2）;移液管；錐形瓶50ml（×3）；吸球、玻棒、滴管、量筒；5.3操作方法 1消化凱氏瓶內(nèi)加入A 0.1ml、B 0.2ml、C 0.25ml和2ml硫酸，半匙催化劑，消化至淡綠色，定容至50ml。2.洗滌定氮儀實(shí)際操作時(shí)，觀察到隨

32、著錐形瓶內(nèi)水量增多，指示劑變棕紅色。第三次洗滌后，指示劑不變色。3蒸餾實(shí)際操作時(shí)，在加反應(yīng)液后，反應(yīng)室內(nèi)液體變成棕黑色，液體反應(yīng)劇烈。指示劑有紅色變成棕色，最后變成綠色。4滴定用0.01N HCl將錐形瓶中的指示劑滴定至淡紫色，記錄消耗HCl的量。5.4結(jié)果與分析5.4.1結(jié)果 表2-9次數(shù)12HCl消耗量/ml0.850.82HCl消耗量（同組）/ml0.750.77樣品含氮量=(A-B) ×N=11mg/ml 樣品含蛋白質(zhì)量=1251mg5.4.2分析（1）、上次用folin-酚法測得的提取液B的蛋白質(zhì)是210.42mg，而此次測得為1251mg，影響原因可能有：A、folin-

33、酚法以Tyr和Trp為中心測，實(shí)際蛋白質(zhì)有其他氨基酸且不一定符合比列；B、凱氏定氮法中不能否定其含有其他含氮物質(zhì)；C、收集氨氣過程中帶入了水蒸氣對硼酸PH影響較大；D、蒸汽洗滌時(shí)間不夠長也可以大致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏大；E、最后滴定過程中，滴定操作的標(biāo)準(zhǔn)與否也對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響較大； （2）、本次試驗(yàn)與上次實(shí)驗(yàn)測定的結(jié)果由較大的出入，其影響結(jié)果的主要因素有：1.收集氨氣過程中帶入了水蒸氣對硼酸PH影響較大；2.蒸汽洗滌時(shí)間不夠長也可以大致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏大；3.最后滴定過程中，滴定操作的標(biāo)準(zhǔn)與否也對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響較大； 5.4.3結(jié)論 樣品含氮量=11mg/ml 樣品含蛋白質(zhì)量=1251mg5.5注意 （1）、

34、消化時(shí)，樣品勿粘于燒瓶壁上； （2）、定氮儀的橡皮管、塞都需處理； （3）、蒸餾時(shí)火不能太猛；5.6認(rèn)識與體會：1、常量凱氏定氮法測總蛋白氮時(shí)可用強(qiáng)酸，微量凱氏定氮法測總蛋白氮必須用弱酸。2、folin-酚法與凱氏定氮法比較： （1）、folin-酚法：操作簡單，靈敏度高，但操作需嚴(yán)格計(jì)時(shí)、干擾多； （2）、凱氏定氮法：費(fèi)時(shí)間，靈敏度比前者低，但干擾少，用于蛋白質(zhì)的測定準(zhǔn)確6 SAS-PAGE測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量6.1實(shí)驗(yàn)原理電泳是指溶液中帶點(diǎn)粒子在外加電場的作用下，向相反電極方向移動的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要取決于它在某PH下所帶的凈電荷量、分子大小（即分子量）和形狀的差異性。聚丙烯

35、酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑過硫酸銨（Ap）和加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠孔徑大小可通過改變Acr和Bis濃度來調(diào)節(jié)。濃度越大，孔徑越小，顆粒穿過網(wǎng)孔的阻力越大，反之亦然。網(wǎng)孔大小根據(jù)所分離物的分子量的大小來選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇分離膠濃度12%。聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)的和不連續(xù)的凝膠電泳兩類。不連續(xù)凝膠電泳有三大效應(yīng)：（1）濃縮效應(yīng)：兩層凝膠的孔徑不同（孔徑的不連續(xù)性）； 緩沖液與凝膠離子成分和pH不同（緩沖系統(tǒng)的不連續(xù)性）（2）分子篩效應(yīng)：顆粒小，圓球形的樣品分子，移動較快；顆粒大，形

36、狀不規(guī)則的分子阻力較大，移動較慢。（3）電荷效應(yīng)：大部分蛋白質(zhì)在pH8.3帶負(fù)電，電荷多遷移快SDS即十二烷基硫酸鈉，是一種陰離子表面活性劑。它可以破壞蛋白質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，形成帶大量負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然電荷的差異；引起蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變。6.2試劑與器材6.2.1試劑 30%丙烯酰胺貯液: 稱丙烯酰胺（AR）29.2g、甲叉雙丙烯酰胺0.8g，先用80ml雙蒸餾水溶解，攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸餾水稀釋至100ml，過濾。用棕色瓶中，4保存一個月。10%的TEMED；10%過硫酸銨（AP）：現(xiàn)用現(xiàn)配。；

37、分離膠緩沖液貯液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：取Tris 9.08g溶解在40ml雙蒸水中，用 4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH8.8，用雙蒸水定容至50mL， 4保存；濃縮膠緩沖液貯液（1.5mol/L Tris-HCl，pH6.8）：取Tris 6.06g溶解在40ml雙蒸水中，用 4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH6.8，用雙蒸水定容至50mL，4保存；2×SDS-樣品緩沖液：1ml濃縮膠緩沖液貯液（1mol/L Tris-HCl，pH6.8）+4ml10%SDS+1ml巰基乙醇+2mL甘油0.5ml0.1%(質(zhì)量濃度)溴酚藍(lán)，加雙蒸水定容至10mL，4保存。SDS-電

38、極緩沖液貯存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3）: 取Tris 15.1g和94g甘氨酸溶解在900ml雙蒸水中，加入50ml 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS貯存液，加雙蒸水定容至1000mL則成5×SDS-電極緩沖液。 10%SDS：25gSDS用雙蒸水定容至250mL，室溫保存。 染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)G-250，加入90mL 50%甲醇溶液和10mL 冰乙酸，用濾紙過濾。6.2.2器材 垂直板型電泳槽；玻璃板; 大培養(yǎng)皿；燒杯；吸量管；滴管6.3 操作方法 1分離酸制備 裝配制膠工具，按表比例配制分離膠，小心加滿水，待聚合好

39、后，傾去水，用濾紙片吸干膠面。 2.濃縮膠制備 按表配置濃縮膠，迅速混勻，倒在分離膠上層，插上梳子，待聚合好后，拔出梳子，用濾紙片去除齒孔中的氣泡。 3.加樣 取100L樣品與100L樣品緩沖液混合，沸水浴3-5min，取20L各樣品加入齒孔中，加一孔Marker，將電極緩沖液倒入電泳槽。4.電泳 調(diào)節(jié)電流，電泳至溴酚藍(lán)距酸前沿1.5cm左右，停止電泳。5.染色和脫色小心取出凝膠，置于平皿中，加染色液中過夜，用脫色液脫色，換兩次脫色液，至背景透明。6計(jì)算樣品相對分子質(zhì)量。6.4結(jié)果與分析6.4.1 結(jié)果 表2-10蛋白質(zhì)分子遷移距離/cm染料遷移距離/cm相對遷移率標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對數(shù)2.944.40.668 144004.1583624921.30 0.295310004.4913616941.19 0.270430004.6334684560.720.1646