腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基本方法

1、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基本方法（一）準(zhǔn)備和安裝過(guò)濾器清洗好過(guò)濾器，干燥，放入一弓孔徑0.22師 的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進(jìn)行高壓滅菌處理在超凈臺(tái)內(nèi)打開(kāi)過(guò)濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過(guò)濾，過(guò)濾后要檢查濾膜是否完好無(wú)損。（二）合成培養(yǎng)基的配制1、根據(jù)細(xì)胞目錄中的說(shuō)明，按下表選擇合適品牌及貨號(hào)的培養(yǎng)基干粉，用適量超純水充分溶解培養(yǎng)基品牌貨號(hào)D-MEM/F-12GIBCO12400024Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (high glucose)GIBCO1280

2、0017F-12 Nutrient Mixture (Ham) powderGIBCO21700075Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) powderGIBCO12200036Leibovitz's L-15 Medium powderGIBCO41300039McCOY's 5ASIGMAM4892Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder(MEM a)with ribonucleosides and deoxyribonucleosidesGIBCO1

3、1900024Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder(MEM a)without ribonucleosides and deoxyribonucleosidesGIBCO12000022Minimum Essential Medium (MEM) powderGIBCO41500034NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'SMODIFICATION (F12K)SIGMAN3520RPMI Medium 1640GIBCO31800022EGFSIGMAE9644Sodium pyruvateSI

4、GMAP2256-25GMEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS AND L-GLUTAMINE,WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTEDSIGMAM50172、按要求添加碳酸氫鈉、谷氨酸鈉、HEPES等，充分?jǐn)嚢枋怪芙狻?、 調(diào)pH至7.2左右。4、加水至最終體積。5、在超凈臺(tái)中對(duì)溶液進(jìn)行濾過(guò)除菌，分裝入 250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口6、瓶口封好，4 c冰箱貯存。（三）小牛血清的處理（近市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理，即通過(guò)加熱的方法破壞補(bǔ)體 來(lái)也有觀

5、點(diǎn)認(rèn)為熱滅活處理是不必要的）。胎牛血清不必滅活。1、將血清加熱至56 c并保持30 min ,其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出2、處理后的血清貯存于 4Co3、小牛血清在使用前最好進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。（四）生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制除無(wú)血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。1 .培養(yǎng)基分裝成小瓶（100200 mL）以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。2 .按如下比例配制：基本培養(yǎng)基占80 %90 %,小牛血清或胎牛血清占10 %20 %。按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液（青霉素+鏈霉素），使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 g/mL ,。

6、（五）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇1 .應(yīng)遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調(diào)至37-37 o 5度，取出凍存的細(xì)胞迅速放入后將細(xì)胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化。2 .在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)將完全培養(yǎng)基加入 50ml的小培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，約5ml左右，然后用無(wú)菌吸管從凍存管內(nèi)取 出細(xì)胞，置培養(yǎng)并內(nèi)輕輕搖晃，使細(xì)胞均勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。（六）傳代：1 .貼壁細(xì)胞：對(duì)于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸（倒）盡培養(yǎng)基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強(qiáng)度減弱（或PBS洗13次）。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml ,按此比例進(jìn)行消化，（根據(jù)經(jīng)驗(yàn)），晃動(dòng)使 消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見(jiàn)細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使

7、細(xì)胞全部脫落，加入 2-3ml完全培養(yǎng)基后，輕輕吹打，使細(xì)胞基本成單個(gè)懸浮，然后分置其它無(wú) 菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。2 .懸浮細(xì)胞：一般傳代可直接將細(xì)胞原液分置其它培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如要高濃度可先離心1000rpm , 5min后加入完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻后，分置其它培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。（七）凍存 將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以完全培養(yǎng)基或胎牛血清重懸細(xì)胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO o以每管12ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過(guò)夜。次日保存到液氮中。（八）注意事項(xiàng)1. 玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)

8、瓶的消毒 :1）高壓蒸汽滅菌15 分鐘以上 ;2）干烤消毒 140 度 2 小時(shí)以上 ;2. 無(wú)菌工作臺(tái)先清洗后用 75% 酒精擦拭干凈， 紫外線照射40 分鐘以上 ;各種培養(yǎng)板照射 3 小時(shí)以上 ;3. 培養(yǎng)基 （pH7.2） 和血清配制好后要做無(wú)菌試驗(yàn):將血清按10% 加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無(wú)菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養(yǎng)基5-10ml 置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3 天，肉眼見(jiàn)無(wú)渾濁或沉淀等異物。分裝后置4 度保存 ;4. 消化液 （pH7.8） 或其它加入液，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，分裝成支置-20 度保存 ;5. 培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用 75% 酒精擦拭一遍（如有紫外線的應(yīng)照射1 小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來(lái)菌） 。至少每月一次。6. 進(jìn)入操作時(shí)應(yīng)注意先清洗雙手及手腕，然后用 75% 酒精擦拭，操作時(shí)注意無(wú)菌