【鹽溶蛋白電泳法鑒定玉米種子純度試驗(yàn)報(bào)告】電泳做玉米種子純度

1、【鹽溶蛋白電泳法鑒定玉米種子純度試驗(yàn)報(bào)告】電泳做玉米種子純度 摘要種子貯藏蛋白是種子基因表達(dá)的產(chǎn)物，可以反映遺傳背景的差異。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)玉米種子鹽溶蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用其電泳譜帶特征鑒定種子純度。玉米鹽溶蛋白電泳譜帶可根據(jù)分子量大小劃分為3個(gè)區(qū)域：區(qū)、區(qū)、區(qū)，其中區(qū)是判斷種子純度的主要依據(jù)，區(qū)其次，區(qū)影響不明顯。結(jié)果說(shuō)明，提取時(shí)間和樣品濃度都對(duì)電泳有重要的影響，過(guò)氧化氫的參加量對(duì)電泳效果影響不大。同時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的其他技術(shù)問(wèn)題進(jìn)行探討。 關(guān)鍵詞玉米；鹽溶蛋白；聚丙烯酰胺凝膠電泳；種子純度 玉米是世界四大糧食作物之一，播種面積僅次于水稻和小麥。我國(guó)的玉米面積穩(wěn)定在2 000萬(wàn)公頃左右，

2、目前幾乎全部是雜交種。從1993年的數(shù)據(jù)看，雖然播種面積比1992年減少了34.94萬(wàn)公頃，但產(chǎn)量卻增加了732.1萬(wàn)噸（劉江等1994）1。玉米產(chǎn)量的提高當(dāng)前主要是依靠?jī)?yōu)良雜交種的普及，而推廣優(yōu)良的雜交種需要大量?jī)?yōu)質(zhì)種子。我國(guó)每年雜交玉米種植124.47萬(wàn)公頃左右，需用雜交種89億千克以上2-3。雜交種中每混雜1%的自交系種子就會(huì)減產(chǎn)0.6%，種子純度每提高1個(gè)百分點(diǎn)，可以增加產(chǎn)量225 kg/hm2，可見(jiàn)種子純度的提高對(duì)玉米產(chǎn)量的增加具有重要的意義4。 品種純度是指某一品種群體在特征、特性方面典型一致的程度，它是種子質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，直接影響作物豐產(chǎn)性、穩(wěn)定性、整齊一致性和抗性5。種子純

3、度檢驗(yàn)包括真實(shí)性鑒定和純度檢驗(yàn)兩個(gè)方面，其實(shí)質(zhì)都是鑒定種子的基因型。目前，國(guó)內(nèi)外普遍采用的鑒定方法有：形態(tài)學(xué)方法、生化方法和分子生物學(xué)方法4，6。鹽溶蛋白電泳法鑒定玉米品種的純度是基于玉米品種間蛋白組成的差異。該方法具有準(zhǔn)確性高、分辨能力強(qiáng)、速度快、經(jīng)濟(jì)便捷、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，因而被列為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（ny/t449-xx）7。本試驗(yàn)采用國(guó)標(biāo)的方法鑒定玉米種子純度，并分析了影響玉米鹽溶蛋白聚丙烯酰胺電泳別離效果的主要因素及電泳操作中應(yīng)注意的問(wèn)題，為玉米純度鑒定工作提供信息和依據(jù)。 1材料與方法 1.1材料 1.1.1試驗(yàn)材料。玉米種子：益豐2號(hào)，冀農(nóng)61號(hào)，泛玉2號(hào)，科河8號(hào)。 1.1.2試劑。丙

4、烯酰胺、n-n亞甲基雙丙烯酰胺、乳酸、乳酸鈉、甘氨酸、抗壞血酸、氯化鈉、蔗糖、甲基綠、三氯乙酸、過(guò)氧化氫、考馬斯亮藍(lán)r-250、冰醋酸、無(wú)水乙醇（化學(xué)試劑均為分析純，水均為去離子水）。 1.2方法 1.2.1樣品制備。參照國(guó)標(biāo)（ny/t449-xx）作適當(dāng)改良：從各樣品中隨機(jī)取種子，用單粒粉碎器粉碎，參加1.5ml離心管中，用滴管參加與樣品體積相同的樣品提取液，搖勻，放置5min后，再搖1次，30min后，用離心機(jī)5 000r/min離心15min，取上清液用于電泳。 1.2.2 凝膠制備。按照玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法（ny/t449-xx）規(guī)定制備。別離膠：丙烯酰胺11.25%，雙丙

5、烯酰胺0.375%；濃縮膠：丙烯酰胺6%，雙丙烯酰胺1%。 1.2.3電泳。在500v電壓下穩(wěn)壓電泳，待甲基綠指示劑移至膠底部邊緣時(shí)，關(guān)閉電源。 1.2.4染色。倒出電極緩沖液，取出膠室，卸下膠條，啟開(kāi)玻璃板，取出膠片，浸入染色液中，室溫染色4h。假設(shè)希望染色速度加快，也可適當(dāng)提高溫度。 2結(jié)果與分析 2.1玉米鹽溶蛋白的譜帶特征 大多數(shù)種子貯藏蛋白在多基因位點(diǎn)上編碼，基因產(chǎn)物顯示幾條蛋白帶（黎裕，1990）8。在品種鑒定中，可根據(jù)特定蛋白帶的有無(wú)或者在電泳凝膠上某一位置出現(xiàn)的譜帶評(píng)價(jià)其特異性（見(jiàn)圖1）。不同的玉米品種由不同的蛋白質(zhì)組成，所以表現(xiàn)在電泳譜帶上就有不同的譜帶類型，玉米鹽溶蛋白電泳

6、就是利用這些差異來(lái)鑒定品種的。 玉米鹽溶蛋白電泳譜帶可根據(jù)分子量大小劃分為3個(gè)區(qū)域：區(qū)、區(qū)、區(qū)。區(qū)由小分子量蛋白質(zhì)組成，區(qū)由中分子量蛋白質(zhì)組成，區(qū)由高分子量蛋白質(zhì)組成。 區(qū)為主要的譜帶區(qū)域，該區(qū)域中蛋白質(zhì)譜帶數(shù)量多，染色深，品種間差異大，為純度鑒定中主要應(yīng)用區(qū)。 區(qū)為次譜帶區(qū)域，該區(qū)域中蛋白質(zhì)譜帶數(shù)量少，譜帶擴(kuò)散，染色淺，品種間差異不太顯著。在純度鑒定中，當(dāng)區(qū)域譜帶差異不明顯時(shí)，可根據(jù)區(qū)域的譜帶差異進(jìn)行鑒定。 區(qū)為輔助區(qū)，該區(qū)域中蛋白質(zhì)譜帶數(shù)量多，染色譜帶細(xì)，易受電泳條件影響。對(duì)于蟲(chóng)蛀、發(fā)霉、生病的籽粒，該區(qū)域譜帶會(huì)局部或全部消失。在該區(qū)域品種間差異較小，不太容易觀察，最好不作為純度鑒定時(shí)用。

7、如果區(qū)和區(qū)無(wú)差異，只有區(qū)有差異時(shí)，最好嚴(yán)格控制操作條件，以到達(dá)良好的重復(fù)性10。 該品種區(qū)和區(qū)很明顯，譜帶多態(tài)性豐富，圖譜清晰，分辨率高，它的主要譜帶區(qū)域即區(qū)很明顯。因此，我們以后用此方法鑒定玉米純度時(shí)，主要看區(qū)的明顯特征，如果不清晰，再看區(qū)特征，對(duì)于區(qū)可以不作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)。我們可以設(shè)想，給每個(gè)地方的品種建立一個(gè)凝膠電泳圖譜庫(kù)，把每個(gè)品種的特征譜帶找出來(lái)，這樣鑒定種子純度時(shí)就可以從圖譜中直接查找匹配的圖譜，以快速鑒定，并且可以判斷出混入了哪些品種10。 2.2玉米鹽溶蛋白電泳的影響因素探討 2.2.1玉米鹽溶蛋白的提取。提取樣品中的蛋白質(zhì)時(shí)提取液參加后要充分搖勻，然后進(jìn)行離心。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比照發(fā)現(xiàn)

8、，提取液參加后充分搖勻，放置10min左右再搖勻1次，再離心提取的效果較好，蛋白的提取量較高，電泳的譜帶較豐富。 2.2.2提取時(shí)間對(duì)電泳效果的影響。保持凝膠組分的濃度不變，將提取時(shí)間改變。結(jié)果說(shuō)明，提取時(shí)間太短，蛋白濃度太低，染色后，譜帶顏色較淺，影響分辨率；提取120min后，局部蛋白質(zhì)水解，譜帶喪失；提取時(shí)間分別為30min和50min時(shí)，蛋白質(zhì)組分多態(tài)性豐富，譜帶清晰，分辨率高。因此，一般提取時(shí)間選為3050min之間。 2.2.3提取液放置4冰箱對(duì)電泳別離效果的影響。將提取35min、離心10min后的樣品放置于4冰箱，1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d后分別對(duì)此樣

9、品進(jìn)行電泳，結(jié)果說(shuō)明，放置后，電泳譜帶沒(méi)有變化，可以繼續(xù)使用，這與張春慶等做的結(jié)論是一致的11。因此，在實(shí)際工作中既可提前提取，也可在電泳前提取。 2.2.4提取液用量對(duì)電泳結(jié)果的影響。在樣品制備中，參加不同體積的提取液。提取液參加過(guò)多，電泳譜帶顏色較淺，原因是樣品中蛋白濃度低，因此染色較淺；提取液參加太少，加樣時(shí)微量加樣器會(huì)吸取到少量種子面粉顆粒，導(dǎo)致譜帶顏色過(guò)深。 2.2.5過(guò)氧化氫參加量對(duì)凝膠聚合速度的影響。過(guò)氧化氫作為凝膠聚合的加速劑，對(duì)凝膠聚合速度有直接影響，其參加量越大，凝膠聚合越快。本實(shí)驗(yàn)對(duì)過(guò)氧化氫參加量設(shè)置不同組合，驗(yàn)證它對(duì)電泳結(jié)果的影響，同時(shí)找出最正確的過(guò)氧化氫用量。結(jié)果說(shuō)明

10、，選用6ml濃縮膠中參加50lh2o2，18ml別離膠中參加25lh2o2時(shí)，電泳效果較好，譜帶清晰。一般隨著催化劑用量的遞增，縮短凝膠聚合時(shí)間，進(jìn)樣小井殘留液減少，凝膠板硬度略有增加，在以后的操作中不易破裂。 本文為全文原貌 未安裝pdf瀏覽器用戶請(qǐng)先下載安裝 原版全文 2.2.6凝膠粘板。主要是玻璃板不干凈。因此，清洗玻璃板時(shí)首先要用軟毛刷把板上的凝膠去除干凈，防止劃撥玻璃板，然后再用海綿等軟的物品清洗，清洗干凈后要用蒸餾水沖洗兩面，垂直放在玻璃板架上自然晾干。假設(shè)粘板嚴(yán)重要更換新的玻璃板12。 2.2.7譜帶的彎曲現(xiàn)象。灌別離膠時(shí)加過(guò)氧化氫進(jìn)行催化，假設(shè)過(guò)氧化氫在別離膠中分布不均勻，會(huì)導(dǎo)

11、致膠體聚合不勻而引起譜帶彎曲。在灌別離膠時(shí)，一定要充分?jǐn)嚢?，用力搖勻后再灌13。 3討論 大多數(shù)種子貯藏蛋白在多基因位點(diǎn)編碼，基因產(chǎn)物顯示幾條蛋白帶（黎裕，1990）7。在品種鑒定中，可根據(jù)特定蛋白帶的有無(wú)或在電泳凝膠上某一位置出現(xiàn)的譜帶評(píng)價(jià)其特異性。玉米鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）鑒定玉米種子純度，譜帶多態(tài)性豐富，且結(jié)果與田間種植純度鑒定方法結(jié)果一致14。因此，鹽溶蛋白page法可以作為玉米純度檢驗(yàn)的可靠方法。標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布、實(shí)施給種子質(zhì)檢中心、廣闊種子經(jīng)銷商提供了一套快速、實(shí)用的室內(nèi)純度檢測(cè)方法，具有本錢(qián)低、速度快、鑒定周期短等特點(diǎn)，解決了種子流通領(lǐng)域過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)的種子質(zhì)量問(wèn)題，防

12、止了不必要的損失，減輕了農(nóng)民負(fù)擔(dān)。該方法具有田間種植不可比較的優(yōu)越性，對(duì)于廣闊使用者來(lái)說(shuō)具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也創(chuàng)造了較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。但是，任何一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的推廣應(yīng)用都是一個(gè)不斷修改、補(bǔ)充、完善的過(guò)程，隨著時(shí)間的推移，本標(biāo)準(zhǔn)將會(huì)逐步完善并且越來(lái)越顯示其重要的應(yīng)用價(jià)值15。 4參考文獻(xiàn) 1 劉江.中國(guó)農(nóng)業(yè)年鑒m.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1994. 2 李家義.國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程m.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1995. 3 李捷，賈廣日.玉米雜交中f1代種植鑒定方法及合格標(biāo)準(zhǔn)j.種子世界，1995（11）：17. 4 孔廣超.玉米種子純度快速鑒定技術(shù)的研究及其指紋圖譜的建立d.石河子：石河子大

13、學(xué)，2000：1-3. 5 王璽.玉米種子純度鑒定技術(shù)體系的創(chuàng)立與應(yīng)用研究d.沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，xx：2-5. 6 汪旭明.雜交玉米種子純度計(jì)算機(jī)視覺(jué)鑒別技術(shù)研究d.沈陽(yáng)：中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)自動(dòng)化研究所，2000：14. 7 李維明，陶學(xué)英，柴宗華，等.鹽溶蛋白電泳法鑒定玉米種子純度應(yīng)注意的問(wèn)題j.甘肅農(nóng)業(yè)科技，xx（11）：15. 8 黎裕.電泳在植物品種鑒定中的應(yīng)用j.種子，1990（4）：53-55. 9 王麗，張守華，陳新民.鹽溶蛋白電泳鑒定玉米種子純度的圖譜分析j.種子世界，xx（5）：291. 10 辛景樹(shù)，趙建宗.雜交玉米種子純度快速鑒定技術(shù)及應(yīng)用前景j.中國(guó)種業(yè)，xx（4）：4-5. 11 張春慶，金錫奎，鄭成超.nau-page技術(shù)與玉米種子純度測(cè)定j.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995，28（6）：20-24. 12 滕開(kāi)瓊，戴鋼，徐立新，等.電泳技術(shù)在種子純度鑒定中的幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題j.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，xx（10）：23. 13 向東山.鹽溶蛋白電泳法鑒定玉米種子純度試驗(yàn)中的幾個(gè)問(wèn)題j.內(nèi)蒙