植物甾醇提純與檢測優(yōu)化研究

1、    植物甾醇提純與檢測優(yōu)化研究    許騰 陳文潔摘 要：本試驗以植物甾醇保健品為原料，對混合植物甾醇進(jìn)行提純精制，并探討優(yōu)化提純方法。其結(jié)果表明：對以乙醇為提純?nèi)軇?，利用響?yīng)曲面法對提純工藝進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果為：料液比1：32.4，結(jié)晶溫度-9.42，養(yǎng)晶時間6.08h，得率66.20%。氣相色譜分析，四種甾醇單體含量分別為菜籽甾醇3.28%，菜油甾醇17.01%，豆甾醇23.59%，-谷甾醇43.86%，總甾醇含量為87.75%。植物甾醇在各種有機(jī)溶劑中存在溶解度和吸附力等性質(zhì)差異，同時，料液比、結(jié)晶時間和結(jié)晶溫度對混合植物甾醇得率有明顯影響。關(guān)鍵詞

2、：植物甾醇;提純;優(yōu)化：tq914.1 ：a ：1671-2064（2019）02-0074-03本試驗運(yùn)用溶劑重結(jié)晶法對混合植物甾醇進(jìn)行提純，并探討甲醇、乙醇和丙酮三種不同溶劑的料液比、結(jié)晶時間和結(jié)晶溫度對混合植物甾醇得率的影響，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化其提純工藝，同時氣相色譜分析。旨在提供植物甾醇提純與檢測分析試驗的方法。1 材料與方法1.1 材料與設(shè)備試劑（均為分析純）名稱：甲醇、無水乙醇、丙酮以及丙酸酐;植物甾醇（市售保健品）。試驗儀器：hh-6數(shù)顯恒溫水浴鍋;heratherm oven烘箱;shz-d（）循環(huán)水式真空泵;sop電子天平;elmasonic p超聲清洗器;7890b氣相色譜

3、儀。1.2 試驗設(shè)計1.2.1 溶劑選擇和提純考慮有機(jī)溶劑的安全性、性質(zhì)差異及穩(wěn)定性等因素，本試驗選用甲醇、乙醇和丙酮為植物甾醇溶劑進(jìn)行提純。1.2.2 重結(jié)晶工藝優(yōu)化準(zhǔn)確稱取2.00g植物甾醇放置于250ml圓底燒瓶中加入溶劑，用電磁攪拌水浴回流使樣品完全溶解并趁熱過濾，冷卻靜置后真空減壓抽濾，置于34恒溫箱真空干燥、稱重，最后計算晶體得率。采用響應(yīng)曲面法（response surface methodology，rsm）3-4對重結(jié)晶工藝優(yōu)化。通過評估結(jié)晶溫度（），料液比（甾醇質(zhì)量/溶劑體積，w/v），養(yǎng)晶時間（h）三個單因素對重結(jié)晶工藝的影響，進(jìn)行三個因素五個水平中心組合的優(yōu)化試驗。1.

4、2.3 氣相色譜分析準(zhǔn)確稱取2.00g植物甾醇，加入1%膽甾醇-吡啶溶液5.0ml、丙酸酐3.0ml，水浴攪拌回流（80），冷卻后經(jīng)0.45m膜過濾，并置于10ml容量瓶中待衍生化后進(jìn)行氣相色譜分析。色譜柱：db-5柱（30m×0.25nm×0.25m）;fid（氫火焰離子檢測器），溫度300;載氣：高純n2，載氣流量75ml/min;進(jìn)樣量1l;試驗時，在色譜柱柱溫60保持2min后，以2/min的速度升至100，再保持2min后以5/min的速度升至270，空氣流量45ml/min，氫氣流量55ml/min，分流比20：1，進(jìn)樣器溫度270。2 結(jié)果與討論2.1 有機(jī)溶

5、劑對重結(jié)晶的影響使用甲醇、乙醇、丙酮為溶劑，在相同養(yǎng)晶時間和料液比及水浴回流溫度的條件下，對植物甾醇重結(jié)晶提純，得到三類植物甾醇晶體。分析三種溶劑中的晶體形狀及得率，無水乙醇得率最高為63.98%，晶形呈白色針尖狀;丙酮次之得率為55.26%，晶形呈白色顆粒狀;甲醇得率最小僅為9.61%，因溶解度較小的緣故，其晶體呈絮狀，顏色淺黃。2.2 單因素初步試驗結(jié)果2.2.1 料液比對重結(jié)晶的影響料液比是植物甾醇質(zhì)量與溶劑體積的比值。當(dāng)料液比增加，溶液過飽和度較低，晶體形狀較好，有利于提高晶體純度，但結(jié)晶速度會變慢，得率較低;當(dāng)料液比降低，溶液過飽和度增大，擴(kuò)散阻力增加，導(dǎo)致晶體易包藏母液，使得結(jié)晶純

6、度不高。植物甾醇得率在三種溶劑中隨料液比的下降而出現(xiàn)先上升后下降的過程，并在料液比1：30時達(dá)到最大值。無水乙醇溶液中晶體得率最高為69.75%，而丙酮中的最大晶體得率為68.48%，甲醇溶液最大晶體得率僅為17.48%，這是因為植物甾醇在甲醇中溶解度最小，結(jié)晶率不高。因此，后續(xù)試驗選擇料液比為1：30。2.2.2 結(jié)晶溫度對重結(jié)晶的影響提高結(jié)晶溫度有利于晶體擴(kuò)散，在較高溫度下生長的晶體，由于結(jié)晶質(zhì)點(diǎn)排斥外來雜質(zhì)的能力增強(qiáng)，晶體質(zhì)量好。但溫度過高會導(dǎo)致結(jié)晶母液的過飽和度下降，晶體不完全析出，得率下降。相反低溫時則晶體生長相對緩慢，雜質(zhì)析出多，晶體質(zhì)量受影響。在三種溶劑中料液比和養(yǎng)晶時間相同條件

7、下，不同結(jié)晶溫度對植物甾醇晶體影響。重結(jié)晶得率均隨結(jié)晶溫度的升高而降低，其中-10為最佳結(jié)晶溫度。2.2.3 養(yǎng)晶時間對重結(jié)晶的影響分別在2.0h，4.0h，6.0h，8.0h時，評價甾醇重結(jié)晶得率受養(yǎng)晶時間的影響?？砂l(fā)現(xiàn)養(yǎng)晶時間對晶體得率影響不大，在約4.0h后趨于平緩，最佳養(yǎng)晶時間為4.0h。2.3 重結(jié)晶優(yōu)化工藝結(jié)果2.3.1 植物甾醇重結(jié)晶響應(yīng)曲面試驗結(jié)果基于單因素試驗結(jié)果，選定響應(yīng)曲面試驗設(shè)計的純化條件為：料液比1：30、結(jié)晶溫度-10、養(yǎng)晶時間4.0h。以乙醇為例，參照design expert軟件的分析結(jié)果對植物甾醇重結(jié)晶工藝進(jìn)行優(yōu)化。使用方差分析進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸模型方程的有效

8、性檢驗，如表1?？砂l(fā)現(xiàn)，該模型f值為39.14，y（p>f）<0.0001。模型的顯著性與y值相關(guān)，當(dāng)y小于0.0500時表明模型影響是顯著的，當(dāng)y值小于0.0100時表明模型影響極顯著，因此a、b、ab、bc對整個試驗的影響均為極顯著。運(yùn)用design expert軟件進(jìn)行分析，得出最佳提純工藝：料液比1：32.6，養(yǎng)晶時間6.08h，結(jié)晶溫度-9.44，植物甾醇的重結(jié)晶得率為66.22%。在具體操作中將應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化后的工藝參數(shù)調(diào)整為：料液比1：30，養(yǎng)晶時間6.0h，結(jié)晶溫度-10。在此參數(shù)條件下進(jìn)行3次乙醇重結(jié)晶試驗，得率為67.26%±0.73%，試驗結(jié)果

9、與回歸方程的預(yù)測值吻合良好。這表明該模型可優(yōu)化控制提純過程的工藝參數(shù)。2.3.2 料液比與結(jié)晶溫度對重結(jié)晶得率的影響依據(jù)回歸方程生成料液比與結(jié)晶溫度的響應(yīng)曲面分析，得到當(dāng)乙醇為溶劑時料液比與結(jié)晶溫度對重結(jié)晶得率。當(dāng)結(jié)晶溫度確定時，重結(jié)晶得率將隨料液比增大而先增加（51.08%64.26%），再逐漸下降（64.26%59.51%）;當(dāng)料液比確定時，得率隨結(jié)晶溫度升高而緩慢下降（51.08%50.23%）。說明料液比與結(jié)晶溫度有相互作用。2.3.3 料液比與養(yǎng)晶時間對重結(jié)晶得率的影響根據(jù)回歸方程生成料液比和養(yǎng)晶時間的響應(yīng)曲面分析，得到當(dāng)乙醇為溶劑時料液比與結(jié)晶溫度對重結(jié)晶得率。當(dāng)養(yǎng)晶時間確定時，重

10、結(jié)晶得率隨料液比增加而先逐漸增大（48.75%63.45%），再緩慢下降（63.45%54.03%）;當(dāng)料液比確定時，得率隨養(yǎng)晶時間的變化趨勢較為平緩（48.75%51.88%），即養(yǎng)晶時間對得率影響小。說明料液比和結(jié)晶溫度有相互作用。2.3.4 結(jié)晶溫度和養(yǎng)晶時間對重結(jié)晶得率的影響根據(jù)回歸方程生成結(jié)晶溫度和養(yǎng)晶時間的響應(yīng)曲面分析，得到當(dāng)丙酮為溶劑時料液比與結(jié)晶溫度對重結(jié)晶得率。當(dāng)結(jié)晶溫度確定時，植物甾醇的重結(jié)晶得率隨養(yǎng)晶時間的增加先增大后下降（58.43%64.74%，64.74%62.85%）;當(dāng)養(yǎng)晶時間確定時，得率隨結(jié)晶溫度增加而逐漸降低（58.43%57.08%）。說明料液比與結(jié)晶溫度

11、有相互作用。2.4 氣相色譜結(jié)果采用標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時間定性法，以膽甾醇為內(nèi)標(biāo)物，通過氣相色譜檢測混合植物甾醇樣品的出峰順序，依次為膽甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和-谷甾醇。見圖1至3。通過面積歸一法計算植物甾醇中各單體含量。以甲醇溶劑對植物甾醇提純時，菜籽甾醇含量最低，為1.87%，-谷甾醇的含量最高，為35.66%，總甾醇含量為73.06%。以乙醇溶劑對植物甾醇提純時，四種單體含量從大到小依次為-谷甾醇>豆甾醇>菜油甾醇>菜籽甾醇，同時總甾醇含量為87.76%。以丙酮為溶劑對植物甾醇提純時，豆甾醇和-谷甾醇含量分別為30.02%和38.01%，較接近，同時總甾醇含量為84

12、.91%?；跉庀嗌V分析結(jié)果，對甲醇、乙醇和丙酮三種溶劑對植物甾醇的提純效果進(jìn)行對比。植物甾醇在甲醇中溶解度小，得率在三種溶劑中最低，不建議用甲醇進(jìn)行提純;當(dāng)以乙醇為提純?nèi)軇r，各單體含量較均勻，-谷甾醇含量最多;用丙酮提純后的植物甾醇純度也比較高，但會有豆甾醇富集，使得各甾醇單體比例發(fā)生變化，如果要使提純后產(chǎn)品與原料中甾醇組成比例相近，最好不用丙酮為重結(jié)晶溶劑。比較植物甾醇晶體形狀發(fā)現(xiàn)，晶形粘稠度、聚合度與豆甾醇含量相關(guān)，形狀差異與-谷甾醇的含量有關(guān)。用甲醇提純后，晶體呈粘稠狀結(jié)塊，晶形不明顯，因為甲醇提純的-谷甾醇最少。用丙酮提純后，晶體粘稠度低、聚合度高，晶形完整，因為丙酮提純的-谷甾

13、醇含量較低。使用乙醇提純后的晶體呈透明細(xì)長針形，因為其中-谷甾醇含量較高。3 結(jié)語（1）使用溶劑提純得率的高低依次是乙醇，丙酮，甲醇。以乙醇為溶劑，最佳提純工藝為：料液比1：32.6，結(jié)晶溫度-9.44，養(yǎng)晶時間6.08h，重結(jié)晶得率為66.22%;通過box-behnken響應(yīng)設(shè)計法分析，植物甾醇和乙醇的料液比（a）、結(jié)晶溫度（b）及養(yǎng)晶時間（c）對響應(yīng)值的多元二次響應(yīng)面回歸模型方程為：y=64.94+2.17a-1.98b+0.49c-9.71 a2-0.86b2-3.42c2-0.17ab-0.72ac+0.27bc。（2）氣相色譜分析，植物甾醇出峰時間的先后順序依次為菜籽甾醇、菜油甾醇

14、、豆甾醇和-谷甾醇。乙醇溶劑的提純效果最好，四種甾醇單體含量為菜籽甾醇3.29%、菜油甾醇17.03%、豆甾醇23.59%、-谷甾醇43.88%，總甾醇含量為87.77%。參考文獻(xiàn)1 canabate d. b. separation and determination of sterols in olive oil by hplc-ms j.food chemistry，2007（102）：593-598.2 凌慶枝，黃秀彥，高莉莉.菜籽油腳衍生氣相色譜-質(zhì)譜分析研究j.糧油加工，2008（6）：61-63.3 animal and vegetable fats and oils-deter