人表皮生長(zhǎng)因子酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

1、人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)酶聯(lián)免疫分析(ELISA )試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用 生長(zhǎng)因子(EGF)含量。目的：本試劑盒用于測(cè)定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中人表皮實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)水平。用純化的人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)，再與HRP標(biāo)記的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物， 經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下 轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)

2、儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(0D值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)濃度。試劑盒組成:試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份圭寸板膜2 片(48)2 片(96)密封袋1個(gè)1個(gè)酶標(biāo)包被板1 M81X962-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品0.5ml X1 瓶0.5ml X 瓶2-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml X1 瓶1.5ml X 瓶2-8 C保存酶標(biāo)試劑3 ml X1 瓶6 ml XI 瓶2-8 C保存樣品稀釋液3 ml X1 瓶6 ml X1 瓶2-8 C保存顯色劑A液3 ml X1 瓶6 ml X1 瓶2-8 C保存顯色劑B液3 ml X1 瓶6 ml X1 瓶2-8 C

3、保存終止液3ml X1 瓶6ml X 瓶2-8 C保存濃縮洗滌液(20ml疋0倍)X1瓶(20ml X30 倍)X 瓶2-8 C保存樣本處理及要求：1血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、者檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再 次離心。3尿液：用無(wú)菌管收集，離心 20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過程 中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、

4、腦脊液參照實(shí)行。4細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心 20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/ 分)。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用 PBS( PH7.2-7.4 )稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度 達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。5組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS, PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持 2-8C的溫度。加入一定量的 PBS （ PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo) 本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（

5、2000-3000 轉(zhuǎn) /分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè), 其余冷凍備用。操作步驟：1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100門然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50門混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100卩I分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50門 混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50卩I棄掉，再各取50卩I分別加到第五、第六孔中，再在第五、 第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50uI，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50卩I分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 H混勻后從第七、第八孔中

6、分別取50卩I加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50卩1混勻后從第九第十孔中各取50卩I棄掉。2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40卩,然后再加待測(cè)樣品10卩1（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置 37C溫育30分鐘。4. 配液：將 30（ 48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。5. 洗滌：小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒后棄去,

7、如此重復(fù)5 次,拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50卩,1空白孔除外。7. 溫育：操作同 3。8. 洗滌：操作同 5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50y,再加入顯色劑B50y,輕輕震蕩混勻，37C避光顯色15 分鐘 .10. 終止：每孔加終止液 50卩,1終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零, 450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（ OD 值）。 測(cè)定應(yīng)在加終 止液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。注意事項(xiàng)：1 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用, 酶標(biāo)包被板開封后如未 用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加

8、溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。3 各步加樣均應(yīng)使用加樣器, 并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好 控制在 5 分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。4 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值）,請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測(cè)定,計(jì)算 時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（X nx 5）。5 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。6 底物請(qǐng)避光保存。7 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).8 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)， OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值