液體MS培養(yǎng)基劇烈振蕩培養(yǎng)法制備大豆成熟胚愈傷組織的實驗設(shè)計_第1頁
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文檔簡介

1、    液體ms培養(yǎng)基劇烈振蕩培養(yǎng)法制備大豆成熟胚愈傷組織的實驗設(shè)計    栗志摘 要:本文設(shè)計并討論了一種通過液體ms培養(yǎng)基劇烈振蕩培養(yǎng)的方式,由大豆成熟胚誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的思路,通過實驗確定了其可行性,并通過實驗和統(tǒng)計,尋找到一種比較適宜的優(yōu)化培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度為25±1、光照10001500lx 12h/d、 蔗糖濃度30g/l、 ph 5.86.0、1mg/l 2,4-d和0.25mg/l 6-ba、 100r/min振蕩培養(yǎng)。關(guān)鍵詞:大豆;成熟胚;愈傷組織;植物組織培養(yǎng);液體培養(yǎng)基;劇烈振蕩;實驗設(shè)計:s-3    

2、;   :adoi:10.19754/j.nyyjs.20201030021引言用植物組織制備愈傷組織是植物組織培養(yǎng)過程中非常重要也非常典型的步驟,也是后續(xù)研究步驟的基礎(chǔ) 1,傳統(tǒng)的愈傷組織制備方法是將消毒后的植物組織接種在生長素、細(xì)胞分裂素等植物激素的固體或半固體培養(yǎng)基上,讓植物組織細(xì)胞在生長分裂的同時逐步脫分化,生長出愈傷組織,隨后這些愈傷組織可用于固體培養(yǎng)或液體懸浮培養(yǎng)等實驗操作。植物組織作為外植體,需要和在植物體內(nèi)相似的環(huán)境來保證生存需要,在傳統(tǒng)方法中之所以接種在含瓊脂的固體、半固體培養(yǎng)基,而非接種在液體培養(yǎng)基上,原因是植物組織組織需要充足的氧氣來滿足持生理活動的需要,如果在

3、靜止的液體培養(yǎng)基中沉沒,會因缺氧會導(dǎo)致生長抑制,甚至導(dǎo)致植物組織死亡,heller(1953)曾采用紙橋法讓植物組織在接觸液態(tài)培養(yǎng)基的同時漂浮在液體培養(yǎng)基表面,以免沉沒缺氧死亡2。大豆(glycine max)是重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物,大豆成熟胚是常用于誘導(dǎo)愈傷組織的材料,常用的大豆胚愈傷組織誘導(dǎo)方法使用的是固體培養(yǎng)基3。本文嘗試通過液體培養(yǎng)基劇烈振蕩培養(yǎng)的方法,讓大豆成熟胚在無瓊脂、無紙橋的情況下,保證氧氣供應(yīng),于液相環(huán)境生長,并設(shè)置不同的條件組合,尋找較為適合液相直接培養(yǎng)法制備愈傷組織的參數(shù),以期打開一條制備原生質(zhì)體的新思路。1 實驗準(zhǔn)備1.1 試驗材料新鮮的大豆(glycine max

4、)種子(品系為南農(nóng)46)。1.2 試劑及設(shè)備有效氯含量為5.5%6.5%的次氯酸鈉溶液、75%乙醇溶液、無菌水、ms培養(yǎng)基、蔗糖、植物生長素2,4-d、細(xì)胞分裂素6-ba、1mol·l-1naoh溶液、精密ph試紙、錐形瓶、棉塞、培養(yǎng)皿、解剖剪、解剖刀、鑷子、超凈工作臺、恒溫?fù)u床。2 實驗步驟挑取新鮮、飽滿、種皮完整、含水量高、未經(jīng)過干燥處理的大豆種子,在75%乙醇溶液中浸泡1min,隨后在5.5%6.5%次氯酸鈉溶液中浸泡5min,用無菌水沖洗4次,于無菌狀態(tài)下用解剖剪和鑷子剝?nèi)シN皮,去除子葉,取出完整的成熟胚作為外植體,用無菌水沖洗后,接種于高溫蒸汽滅菌冷卻后的加入不同激素濃度的

5、液態(tài)ms培養(yǎng)基上,以不同振蕩轉(zhuǎn)速在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。選用ms作為培養(yǎng)基,用1mol·l-1 naoh溶液調(diào)節(jié)ph。4個固定參數(shù)為:培養(yǎng)溫度25±1、光照10001500lx 12h·d-1、蔗糖濃度30g·l-1、ph 5.86.03-5。2個變動參數(shù)為:振蕩轉(zhuǎn)速分為6檔: 25r·min-1,50r·min-1,75r·min-1,100r·min-1,125r·min-1,150r·min-1。植物激素濃度分為5檔:無激素、0.5mg·l-1 2, 4-d + 0.125mg

6、3;l-1 6-ba、 1mg·l-1 2, 4-d + 0.25mg·l-1 6-ba、 2mg·l-1 2, 4-d + 0.5mg 6-ba、4mg·l-1 2, 4-d + 1mg 6-ba 。每份液體培養(yǎng)基的體積為50ml,接種的大豆胚數(shù)量為3個,相同條件重復(fù)樣本數(shù)量為3個,每24h觀察1次胚形態(tài)的變化和愈傷組織的誘導(dǎo)狀況,接種14d后稱取、計算愈傷組織的平均重量。3 實驗結(jié)果振蕩轉(zhuǎn)速和大豆成熟胚愈傷組織生長情況存在顯著的相關(guān)性(參見圖1)。在25r·min-1轉(zhuǎn)速情況下,大豆成熟胚呈現(xiàn)一定程度的浸沒缺氧狀態(tài),生長速度較為緩慢甚至逐步

7、停滯,愈傷組織誘導(dǎo)效率很低;在50r·min-1轉(zhuǎn)速下,大豆成熟胚浸沒缺氧狀態(tài)明顯減輕,生長速度顯著加快,愈傷組織誘導(dǎo)效率提升;75r·min-1轉(zhuǎn)速下,大豆成熟胚基本不表現(xiàn)出浸沒缺氧狀態(tài),生長速度和愈傷組織誘導(dǎo)效率繼續(xù)提升;100r·min-1轉(zhuǎn)速下,大豆成熟胚不表現(xiàn)出浸沒缺氧狀態(tài),生長速度和愈傷組織誘導(dǎo)效率趨于頂峰;125r·min-1和150r·min-1轉(zhuǎn)速下,大豆成熟胚不表現(xiàn)出浸沒缺氧狀態(tài),生長速度和愈傷組織誘導(dǎo)效率相比于100r·min-1只有輕微波動,顯示出近似“飽和”的狀態(tài),但過于劇烈的振蕩狀態(tài)不僅耗費(fèi)更多能量,也會產(chǎn)

8、生較多泡沫,不利于下一步的實驗操作。根據(jù)文獻(xiàn)資料,在固體ms培養(yǎng)基上,大豆成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)最適的2,4-d和6-ba濃度為2mg·l-1和0.5mg·l-13-5,但在液體培養(yǎng)基中,最適2,4-d和6-ba濃度有所不同(參見圖2),相比于無激素組,添加0.5mg·l-1 2, 4-d和0.125mg·l-16-ba、1mg·l-1 2, 4-d和0.25mg·l-16-ba可以在一定程度上增加愈傷組織的誘導(dǎo)效率,但2mg·l-1 2, 4-d和0.5mg·l-16-ba、4mg·l-12, 4-d和1m

9、g·l-16-ba對愈傷組織誘導(dǎo)有抑制效果,其中4mg·l-12, 4-d和1mg·l-16-ba的抑制效果尤為明顯。根據(jù)逐日觀察的記錄,大豆成熟胚在液體ms培養(yǎng)基中的生長可分為3個階段(參見圖3):13d:胚生長階段,胚不斷膨脹、伸長,體積顯著增加,但形態(tài)不發(fā)生明顯變化。48d:生根階段,胚開始長出根系,根系隨著時間推移不斷延伸,形態(tài)發(fā)生明顯變化。914d:愈傷組織生成階段,形態(tài)進(jìn)一步變化,在上胚軸的位置開始出現(xiàn)愈傷組織,呈現(xiàn)白色到淡黃色不規(guī)則團(tuán)塊狀、質(zhì)地較為堅實,隨著時間推移顯著膨脹。4 結(jié)論與分析以大豆成熟胚作為外植體,通過液體ms培養(yǎng)基劇烈振蕩培養(yǎng)得到愈傷組織的方法被證明具有一定可行性,可作為一種和固體培養(yǎng)基法、紙橋法平行存在的愈傷組織誘導(dǎo)方法,值得進(jìn)一步的研究和實驗。目前得到的比較適合的培養(yǎng)優(yōu)化條件是:培養(yǎng)溫度為25±1、光照1000-1500lx 12h·d-1、 蔗糖濃度30g·l-1、 ph 5.86.0、1mg·l-1 2,4-d和0.25 mg·l-1 6-ba、 100r·min-1振蕩培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)1 安利國,楊桂文.細(xì)胞工程m.第3版.科學(xué)出版社,2015:155,160.2 張郁松.影響大豆愈傷組織的誘導(dǎo)因素研究j.大豆科學(xué),2007(01):6

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