畢赤酵母高拷貝篩選、鑒定SOP_第1頁
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文檔簡介

1、畢赤酵母重組子高拷貝篩選.鑒定sop一、儀器、培養(yǎng)基、耗材1 儀器恒溫培養(yǎng)箱pcr儀電泳儀2 培養(yǎng)基ypd固體/液體培養(yǎng)基md培養(yǎng)基mm培養(yǎng)基3 耗材96孔板滅菌才簽二、實驗操作1.高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選需要三組各兩塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(共6塊)來篩選。通過持續(xù)接種,得到相 同濃度的克隆子,以確保zr平板上細(xì)胞數(shù)相等。記住要有菌株背景對照及單拷 貝基因?qū)φ?。一般?80個克隆,可選出15個髙拷貝克隆。1.1無菌條件下,將每個96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上加入200pl ypd:1.2用滅菌牙簽在第一組平板中每孔接種單個zr垂組子以及空白畢赤酵母x33(gs115)、gs115/albumin 和 gs115/pp

2、icz/lac乙 輕輕攪動以懸浮細(xì)胞, 蓋住微量測定板30度孵育2天(不需搖動);1.3天后,取新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入190gl ypd,用多道移液器吸取10|11 培養(yǎng)液于第二組測定板中,30度孵育過夜(不需搖動);1.4第二天,取新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入190mypd,用多道移液器吸取10|il 培養(yǎng)液于第三組測定板中,30度孵育過夜(不需搖動);注意:如此,持續(xù)生長及傳代可使克降達(dá)到相同細(xì)胞濃度1.5孵育后,取第三組板,用100卩1多道移液器上下吹打重新懸浮細(xì)胞;1.6取12小每孔中液體點在含zeocin濃度為0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml 的ypd平板上;

3、in用多道移液器或在平板底下劃線,確保以規(guī)則方式排列。1.7待液體吸收,將板放于30度,25天后檢測,分析結(jié)杲。也可選擇直接表達(dá)來看是否有克隆及人量表達(dá)口的蛋白。先檢測所有zr克 降的mu(+表型,zr的me表型重組子明顯大量表達(dá)蛋白,用southern blot分析拷 貝數(shù),確定拷貝數(shù)冃(確保劃線純化單克隆,并加入甘油冰凍保存zr抗性克隆, 每次從凍存樣本中挑菌開始表達(dá)研究而不是從老的平板上挑菌)。2. mut十表型菌株的篩選把篩選出的高拷貝重組子同時點在md和mm兩塊板上。在md和mm板 上生長差別不大的重紐子為muf;相反,在md±生長快,mm±生長很慢的重 組子為

4、muts ,同時點酵母 gs115/albumin 或 km71 或 km71h (muts)和 x-33 或gs115/ppicz/lacz(mut+)菌落作對照,以便篩選時判斷高拷貝重組子的mut+ 或 mutso3.畢赤酵母重組子的pcr及測序鑒定3.1搖菌挑取高拷貝轉(zhuǎn)化子單菌落于5ml ypd液體培養(yǎng)基屮,30°c 250r/min振蕩培養(yǎng)過夜。3.2畢赤酵母基因組dna提取煮凍煮法提畢赤酵母基因組dna:取2.5.1培養(yǎng)的菌液1ml于1.5ml滅菌的ep管屮,2500xg離心5min,棄上清,沉淀屮加入500卩1的pbs溶液懸浮沉 淀,2500xg離心3min;棄上清,沉淀

5、溶于100(11 te,沸水浴lomin, 70°c冷 凍30min,再次沸水浴lomin, 1500xg離心5min,取上清為模板做pcr。注:實踐及文獻(xiàn)證明煮凍煮法提取酵母基因組效率較低,容易造成假陰性!天根公司酵母基因組提収試劑盒效果較好。3.3pcr擴(kuò)增鑒定反應(yīng)體系:loxbuffer5(1110mm dntp3(il模板dna2plpll|ilp2lpltaq酶iplmgcl24|ilddh2033.0pl總體積50.0plpcr反應(yīng)程序:95°c預(yù)變性5min;94°c50s, 55°c50s, 72°c 2 min,擴(kuò)增 30 個循環(huán);72°c延仲 lomin;4 °c, oo。3.4 pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳取pcr產(chǎn)物5|11, 1%瓊脂糖凝膠電泳,120v, 30-50

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