不同抽薹性蘿卜遺傳多樣性的SSR分子標記分析

1、不同抽薹性蘿卜遺傳多樣性的SSR分子標記分析p 【摘要】：p ：為了加強對耐抽薹蘿卜種質(zhì)資的研究，加快耐抽薹蘿卜育種進程，從206對SSR分子標記引物中篩選出21對，用于57份不同抽薹性蘿卜材料進行遺傳多樣性分析p 。結(jié)果表明，PCR共擴增出102條條帶，平均4.86條，每對引物29條帶，其中具有多態(tài)性的為95條，多態(tài)性條帶百分率為93.14。POPGENE分析p 結(jié)果表明，平均觀測等位基因數(shù)為2.967 4，平均有效等位基因數(shù)為2.419 1，有效等位基因比例為81.52;平均Nei基因多樣性指數(shù)為 0.355 5，平均Shannon多態(tài)性指數(shù)為0.528 9。UPGMA法聚類結(jié)果把供試蘿卜

2、材料分為3個類群，5個亞類：第類為來于德國的極耐抽薹材料，第類為來于韓國和日本的耐抽薹材料，第類為來于我國的材料，其中第3亞類共有45份，占材料總數(shù)的78.95，第4亞類為5份極易抽薹材料，第5亞類僅有1份。各材料間平均遺傳相似系數(shù)為0.638 1，變幅范圍0.347 80.934 8，>0.7的僅22.87，遺傳差異較大。不同抽薹性蘿卜材料所表現(xiàn)出的豐富多樣性，對蘿卜種質(zhì)資管理和耐抽薹品種選育具有重要意義?！娟P鍵詞】：p ：蘿卜;抽薹;SSR標記;遺傳多樣性中圖分類號： S631.103 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（20_）04-0123-05蘿卜（Raphanus

3、 sativus L.）在世界各地均有種植，其中歐美國家主要栽培小型四季蘿卜，亞洲國家則主要栽培大型蘿卜1。蘿卜是我國重要的十字花科蔬菜作物，年種植面積在120萬hm2左右，位居全國各類蔬菜種植面積第3位，在蔬菜生產(chǎn)和供應上起到了重要作用2。在生產(chǎn)上，蘿卜比較容易發(fā)生“未熟抽薹”或“先期抽薹”現(xiàn)象，即蘿卜肉質(zhì)根在未完全膨大時就抽薹，從而降低或失去商品價值，造成經(jīng)濟損失。我國擁有眾多蘿卜種質(zhì)資，但開始耐抽薹品種選育的研究較晚，導致日本和韓國的耐抽薹品種大量進入國內(nèi)，占據(jù)主要市場。因此，加強對耐抽薹蘿卜種質(zhì)資的研究，不斷培育新的種質(zhì)資，是加快耐抽薹蘿卜育種進程的重要途徑。簡單序列重復（simple

4、 sequence repeat，SSR）通常又稱為微衛(wèi)星或者STMS（sequence-tagged microsatellites），是基于PCR的分子標記，普遍分布于真核生物基因組中，具有信息含量高、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、操作和分析p 簡單等優(yōu)點，現(xiàn)被廣泛用于蔬菜種質(zhì)資遺傳多樣性分析p 3及種質(zhì)資鑒定4等研究。近幾年以蘿卜為材料利用SSR標記進行的研究，主要包括圖譜構建5-7、基因組學8、轉(zhuǎn)錄組學9、表觀遺傳學10、純度鑒定11-12、育性鑒定13和肉質(zhì)根色14等方面。本研究對57份不同抽薹性蘿卜材料進行SSR分析p ，旨在從分子水平上研究各材料遺傳背景和親緣關系，為選育耐抽薹蘿卜品種提供

5、理論依據(jù)，以期實現(xiàn)分子標記輔助育種。1 材料與方法1.1 材料供試57份不同抽薹性蘿卜材料，均由四川省農(nóng)業(yè)科學院水稻高粱研究所蘿卜課題組提供。材料來及其抽薹特性詳見表1。分子標記所需的SSR引物由四川成都擎科梓熙生物技術有限公司合成，Taq酶和dNTP購自生工生物工程（上海）股份有限公司。1.2 方法1.2.1 DNA提取 20_年2月26日，在蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點實驗室進行蘿卜穴盤育苗，待幼苗長至3張真葉時采嫩葉，用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的高效植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，微量分光光度計（NanoDrop 20_）檢測DNA濃度和質(zhì)量，將DNA濃度調(diào)至10 n

6、g/L，-20 冰箱（海爾醫(yī)用低溫保存箱）保存?zhèn)溆谩?.2.2 PCR擴增及檢測 用Veriti Thermal Cycler PCR儀（lied Biosystems公司）進行擴增。SSR-PCR反應采用 15 L 體系，包括1.5 L 10×PCR buffer（Mg2+）、1.0 L 2.5 mmol/L dNTP、0.2 L 5 U/L Taq酶、50 ng/L上、下游引物各0.5 L、2.0 L DNA模板，加ddH2O至15 L。擴增程序：94 預變性 5 min;94 變性40 s，5562 （不同SSR引物設不同退火溫度）退火45 s，72 延伸90 s，35個循環(huán);

7、72 延伸10 min，4 保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)10非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測。1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析p 將銀染結(jié)果進行統(tǒng)計，清晰且可重復條帶記為“1”，不重復且在同一位置上的弱帶或無條帶記為“0”，建立數(shù)據(jù)庫。統(tǒng)計PCR擴增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，計算多態(tài)性條帶百分率P=i/j×100，其中i為多態(tài)性條帶數(shù)，j為擴增總條帶數(shù)。用POPGENE 1.32統(tǒng)計觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei基因多樣性指數(shù)（H）及Shannon多樣性信息指數(shù)（I）15。利用NTSYS pc-2.10e分析p 數(shù)據(jù)，按非加權組平均法（UPGMA）進行聚類分析p 16。2 結(jié)

8、果與分析p 2.1 SSR引物多樣性分析p 搜索蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫（：/marker.kazusa.or.jp/Daikon/及：//cgi-bin/ radish/）中公布的與抽薹開花相關的SSR引物序列信息，合成了206對，并從中篩選出21對擴增條帶清晰、多態(tài)性明顯較好的引物。分別對57份材料進行PCR擴增，21對SSR引物的擴增結(jié)果如表2所示，共擴增出102條條帶，每對引物擴增出29條條帶，平均4.86條，其中具有多態(tài)性的95條，多態(tài)性條帶百分率為93.14。表明本研究中篩選到的SSR引物多態(tài)性良好，有較顯著的檢出效率，可用于后續(xù)的遺傳多樣性分

9、析p 。2.2 遺傳多樣性分析p 通過POPGENE 1.32軟件分析p ，得到表3結(jié)果，57份供試材料的平均觀測等位基因數(shù)為2.967 4，平均有效等位基因數(shù)為2.419 1，有效等位基因比例為81.52。統(tǒng)計分析p 表明，平均Nei基因多樣性指數(shù)為0.355 5，平均Shannon多態(tài)性指數(shù)為0.528 9，均反映出供試材料較高的遺傳多樣性。2.3 聚類分析p 應用Masatoshi等的統(tǒng)計分析p 方法17，計算遺傳相似系數(shù)（GS），共獲得1 596個兩兩不同材料間的遺傳相似系數(shù)（表4），變幅為0.347 80.934 8，平均遺傳相似系數(shù)為 0.638 1，>0.7的僅占22.87

10、，其中18和19號材料間遺傳相似系數(shù)最大，為0.934 8，說明二者間親緣關系最近;2和18、31號間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.347 8，說明它們之間的親緣關系最遠。由此可知，57份材料的遺傳背景豐富，可作為育種資。根據(jù)遺傳相似系數(shù)采用UPGMA法進行聚類分析p ，結(jié)果如圖1所示。以0.57為閾值可以把57份材料分為三大類群：第類包括1、2、3號材料，共3份，均為來于德國的極耐抽薹材料，占所有極耐抽薹材料的50;第類為4、5、6號材料，共3份，來于韓國和日本;第類為其他51份材料，均來于我國。進一步分析p 可以把第類分為3個亞類（第3、4、5亞類）：第3亞類共有45份，占所有供試材料的78.

11、95;第4亞類共有5份，均為極易抽薹材料，占所有極易抽薹材料的83.33;第5亞類僅有42號材料。3 討論與結(jié)論遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息的總和，對分析p 重要性狀和輔助育種具有重要意義。本研究中，SSR引物及遺傳多樣性結(jié)果說明，供試材料間遺傳相似程度較低，不同抽薹性蘿卜間遺傳差異較大，遺傳關系較遠，這與Wang等利用EST-SSR標記進行遺傳多樣性分析p 所得結(jié)果中引物多態(tài)性89.3、平均多態(tài)信息含量（PIC）值0.3918相似。同時聚類分析p 結(jié)果中，本研究分類出的第大類與其研究分類得到的第大類較為相似，但其余分類結(jié)果差異較大。方平等對肉質(zhì)色不同蘿卜遺傳多樣性的分析p 結(jié)果中，平均N

12、a、Ne、I、GS值分別為8.7、5.162 7、1.76、0.8519，本研究結(jié)果與其差異較大。不同結(jié)果的產(chǎn)生，可能與材料來的豐富程度尤其是野生型材料的多少有關。由于研究目的性狀的不同，所選用的分子標記差異較大，對遺傳多樣性結(jié)果的影響較大。抽薹性狀為數(shù)量性狀，受外界環(huán)境影響大，在十字花科蔬菜中的相關研究較多。陳文輝等利用2種分子標記分析p 耐抽薹大白菜的遺傳多樣性，其中SRAP標記的平均多態(tài)性條帶和比率均比ISSR標記高，平均GS值較小而GS變幅較大，來日本、韓國和我國山東的品種各聚為一類，反映出耐抽薹大白菜間存在一定的地域差異20。高穎等利用57個SSR和InDel標記對大白菜抽薹開花時間

13、進行關聯(lián)分析p ，將80份自交系及110份F1材料分為3個亞群體，發(fā)現(xiàn)13個標記的17個位點與抽薹時間和開花時間相關21。在耐抽薹蘿卜研究上，柳李旺等將甲基化敏感擴增多態(tài)性技術（MSAP）應用于蘿卜抽薹機理研究中，證明了DNA甲基化水平的變化影響蘿卜抽薹開花，揭示了甲基化水平降低有利于抽薹開花相關基因的表達22。劉哲等對蘿卜抽薹相關SRAP分子標記進行篩選與分析p ，獲得116對多態(tài)性引物組合，多態(tài)性40.3，多態(tài)性條帶范圍為05，得到1個與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖的標記，遺傳距離為5.7 cM23。本研究中，來于德國的極耐抽薹蘿卜材料分在第大類，日本的極耐抽薹材料時大根在第大類，第大類中則包括

14、了極耐抽薹的藏蘿1號和自育的C60223，三類間的親緣關系較遠。其中，日本的時大根與黑蘿卜、藏蘿1號和C60223間的GS值分別為0.46、0.50、0.43，遺傳差異大，可作為耐抽薹雜交親本材料加以利用。同時，本研究的聚類結(jié)果可將大部分地理來相近的材料聚為一類，但與抽薹性狀之間仍存在差別。例如，第4亞類將來于我國的極易抽薹蘿卜材料聚為了一類，但第3亞類中卻不能較好地區(qū)別開抽薹性不同的材料。這可能是由于SSR標記體現(xiàn)的是種質(zhì)材料間分子水平上的差異，而表型性狀差異是環(huán)境與基因互作的結(jié)果。不同抽薹性蘿卜材料所表現(xiàn)出的豐富多樣性，對蘿卜種質(zhì)資管理和耐抽薹品種選育具有重要意義。本研究結(jié)果能在一定程度上

15、反映出不同抽薹性蘿卜材料間的親緣關系，后續(xù)選擇遺傳相似度低、親緣關系遠的材料作為親本應用于育種，以提高后代遺傳重組率，增強雜種優(yōu)勢。同時，應注意多種分子標記的結(jié)合，以期獲得更可靠的聚類結(jié)果?！緟⒖嘉墨I】：p ：1方智遠.中國蔬菜育種學M.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，20_：703.2汪隆植，何啟偉.中國蘿卜M.北京：科學技術文獻出版社，20_5：1314.3唐榮華，張君誠，吳為人.SSR分子標記的開發(fā)技術研究進展J.西南農(nóng)業(yè)學報，20_2，15（4）：106-109.4王曉武，杜永臣.蔬菜作物分子育種研究現(xiàn)狀與趨勢J.中國農(nóng)業(yè)科技導報，20_7，9（2）：14-18.5邱 楊，李錫香，霞，等.利用S

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