Infusion技術(shù)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1Infusion技術(shù)技術(shù)December 5, 20212 TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺點(diǎn)：連接效率低 耗時(shí)較長(zhǎng) 需要特定限制性酶切位點(diǎn)第1頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 20213 Clontech專(zhuān)利In-Fusion HD Cloning System任意載體任意基因片段這是一款讓您隨心所欲地實(shí)現(xiàn)基因定向克隆的產(chǎn)品！ 第2頁(yè)/共32頁(yè)4 第3頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 20215 2In-Fusion優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹4常見(jiàn)問(wèn)答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理第4頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 20216 主要內(nèi)容2In-Fu

2、sion優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹4常見(jiàn)問(wèn)答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理第5頁(yè)/共32頁(yè)In-Fusion專(zhuān)利酶Clontech專(zhuān)利In-Fusion是一種快速、簡(jiǎn)單、高效的基因克隆技術(shù)！50 ，15 min單管反應(yīng)7 第6頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 20218 主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹4常見(jiàn)問(wèn)答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理第7頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 20219 不附加任何多余序列2不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制3可同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)DNA片段 41簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù)第8頁(yè)/共32頁(yè)D

3、ecember 5, 202110 快速！第9頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202111 In-Fusion HD無(wú)論是克隆長(zhǎng)基因片段還是克隆多個(gè)基因片段都能保持較高的克隆效率。 高效！簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù)第10頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202112 線性化載體任意載體克隆位點(diǎn)目的DNA片段不需要的堿基序列引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增與載體相同的15 個(gè)堿基 序列In-Fusion連接反應(yīng)15 min 不附加任何多余序列的重組載體無(wú)縫克?。翰桓郊尤魏味嘤嘈蛄蠥BC第11頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202113 In-Fusion克隆不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制: 在cDN

4、A序列中插入內(nèi)含子,熒光蛋白基因 在cDNA序列添加UTRs 轉(zhuǎn)換純化標(biāo)簽例如Myc 轉(zhuǎn)換為His 缺失蛋白表達(dá)區(qū)域表達(dá)載體選擇插入位點(diǎn)PCR擴(kuò)增純化目的DNA片段混合In-FusionIn-Fusion引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增 重組載體第12頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202114 Step 2: 目的DNA片段擴(kuò)增Step 3: 一次In-Fusion連接反應(yīng)Step 1: 制備線性化載體片段1片段2片段3線性化載體重組載體第13頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202115 克服其它克隆技術(shù)的限制其它克隆技術(shù)的限制In-Fusion解決方案載體的限制 不同克隆試劑盒都需要與之匹配的載

5、體必須使用提供的載體只要載體末端和插入片段末端具有15個(gè)同源堿基， In-Fusion就可以將任意PCR片段插入任意線性化載體中。必須進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切和連接需要獨(dú)一無(wú)二、兼容的酶切位點(diǎn)極少的合適酶切位點(diǎn)In-Fusion不受限制性酶切位點(diǎn)的限制，因此在目的片段及使用的載體中是否存在合適的酶切位點(diǎn)并不妨礙克隆。亞克隆繁瑣多片段不能同時(shí)克隆In-Fusion能夠在一次反應(yīng)中同時(shí)克隆多個(gè)片段，無(wú)需進(jìn)行亞克隆。對(duì)于大片段克隆效率較低對(duì)于插入片段有限制In-Fusion系統(tǒng)能夠高效克隆0.05-15 kb DNA片段。非定向克隆需要篩選目的片段插入方向 正確的克隆In-Fusion是基因定向克隆技術(shù)

6、，因此無(wú)需進(jìn)行目的基因片段正確插入的克隆的篩選。會(huì)附加多余堿基序列In-Fusion是無(wú)縫克?。翰桓郊尤魏味嘤鄩A基序列。不適合中型和大規(guī)?？寺」こ蘄n-Fusion技術(shù)已經(jīng)成功用于多項(xiàng)高通量克隆工程。第14頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202116 多片段克隆構(gòu)建載體模型插入突變位點(diǎn)高通量克隆第15頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202117 應(yīng)用實(shí)例實(shí)例：多個(gè)DNA片段（1 kb, 2 kb, 3 kb)同時(shí)克隆【方法】使用TaKaRa高品質(zhì)PCR酶分別擴(kuò)增1 kb、2 kb、3 kb的目的DNA片段 和2.7 kb的載體，并將擴(kuò)增產(chǎn)物混合，使用In-Fusion HD試劑盒完成

7、克隆。利用高效率的感受態(tài)細(xì)胞StellarTM Competent Cells（產(chǎn)品編 號(hào)：636763）轉(zhuǎn)化并進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選。第16頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202118 引物的5末端必須包含與載體末端相同的15個(gè)堿基序列引物的3末端必須包含與目的基因片段相互補(bǔ)的特異堿基序列第17頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202119 PCR擴(kuò)增酶切處理第18頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202120 In-Fusion專(zhuān)利酶線性化載體目的基因片段反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化In-Fusion連接反應(yīng)50 15 min 【結(jié)果】Cloning Enhancer處理，37 15 min， 80

8、15 min 第19頁(yè)/共32頁(yè)引物的5末端必須包含與載體末端相同的15個(gè)堿基序列引物的3末端必須包含與目的基因片段相互補(bǔ)的特異堿基序列December 5, 202121 第20頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202122 第21頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202123 在線支持工具第22頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202124 主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹4常見(jiàn)問(wèn)答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理第23頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202125 第24頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202126 5X In-Fu

9、sion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector, linearized (50 ng / l)2 kb Control Insert (40 ng / l) In-Fusion HD Cloning Kit（ 639648/49/50)組分第25頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202127 Cloning Enhancer的作用：消除PCR反應(yīng)液中的引物二聚體和dNTP等的影響無(wú)需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠純化操作簡(jiǎn)單In-Fusion HD Cloning Kit w/ Cloning Enhancer (639633/34/35)第26頁(yè)/共32頁(yè)Dece

10、mber 5, 202128 Up to 5X Higher Efficiency未經(jīng)處理Cloning Enhancer處理Cloning Enhancer的實(shí)用例第27頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202129 主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹4常見(jiàn)問(wèn)答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理第28頁(yè)/共32頁(yè)December 5, 202130 Q1.如何選擇PCR酶？A1.可以使用任何PCR酶。由于科研人員進(jìn)行克隆表達(dá)的實(shí)驗(yàn)較多，我們推薦使用高保真的PCR酶。Q2.載體和插入的DNA片段末端結(jié)構(gòu)有限制嗎？A2.沒(méi)有特別的限制。無(wú)論是平滑末端、粘性末端或者末端有無(wú)A尾均可 進(jìn)行有效的連接反應(yīng)。 Q3.載體和插入的DNA片段的長(zhǎng)度有限制嗎？A3.沒(méi)有特別的限制。載體和插入的DNA片段即使超過(guò)10 kb也可以進(jìn) 行連接反應(yīng)，只是連接效率會(huì)有所降低。插入的DNA片段只要不少 于50 bp就可進(jìn)行有效的連接反應(yīng)。Q4.線性化載體