一抗和二抗的選擇

1、一抗的選擇檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，為縮小抗體的選擇范圍選中合適的抗體，需要考慮如下幾種因素：分析試驗應用的類型l樣本蛋白的結構性質(zhì)l樣本的種屬l抗體宿主的種類l抗體的標記和檢測l1. 分析試驗應用的類型一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗驗證過適用于何種分析類型，如：可以應用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗體說明書沒有提及的應用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應用類型，而僅是說 明尚未經(jīng)過此種分析試驗驗證，如果抗體不適用某些分析試驗，則會在抗體說明書上標注出來不適于某分 析試驗。2. 樣本蛋白的結構性質(zhì)了解樣本蛋白的結構性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，至少兩方

2、面因素需要考慮待測樣本蛋白的結構域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、 蛋白片斷、多肽、全有機體（如：細菌）或細胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述，如果打算檢測的是 蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS流式檢測活細胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。l樣本的提取或處理過程：某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特殊處理，例如：許多抗體只識別還原和變性的、表 位已暴露不受二級四級結構阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當選擇免 疫組化的抗體時，應注意某

3、些抗體只識別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無需抗原修復解交 聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會在抗體說明書上應用部分標示出來l3. 樣本的物種應選擇物種相同或有交叉反應的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應，因其氨基酸序列同 源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測該 物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗證過，應通過序列比對的方法來預測交叉反應，可應 用Expasy和NCBI BLAST來進行不同物種蛋白同源性比對。4. 一抗宿主物種的選擇一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結合無偶聯(lián)物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇較

4、為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分 子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔 IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的 其它對不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對不含IgG的細胞裂解物樣本的western blotting 檢測，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot 檢測中則結合出現(xiàn)IgG分子50 and

5、 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。如何選擇二抗根據(jù)一抗種屬及類型選擇合適的二抗 廣義上是指專門和進行特異性反應和結合的抗體，在免疫學反應中，經(jīng)常需要針對試驗選擇不同的二抗， 艾美捷能為您的科研工作提供最適合和最全面的二抗產(chǎn)品。檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選 擇，同時在后繼試驗中也會有不同的檢測方案，因此在選擇二抗的時候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測 方案的要求，一般來說，選擇合適的二抗需要從下面幾個方面考慮：【一抗的種屬來源】二抗應選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠 的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可)；如果一抗是從兔血清里制備的兔

6、源多克隆抗體，則相應的二 抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來源選擇相應的抗該物種的二抗。艾美捷能為您提供最全的抗 不同種屬的原裝進口二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、人、豚鼠、豬、馬、牛、雞、鴨等二抗?！疽豢沟念悇e亞型】二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體。其中單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品說明書中都會有描述，如果 你的一抗是小鼠IgM，那么相應的二抗就應當是抗小鼠IgMo如果單克隆一抗是/J、鼠IgG的某一亞類(IgG1,IgG2a , IgG2b, IgG3),那么幾乎所有的抗小鼠Ig

7、G都可以與之結合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1 ,那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應物種IgG。艾美捷能為您提供通用的IgG(H+L)二抗，或者特異性只結合 IgM 的 Anti IgM (m。Antibody、IgA 的 Anti IgA (alpha-Antibody 、 IgE 的 Anti IgE (epsilon ) Antibody 等?！径沟姆N屬來源】一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的 實驗里沒有太

8、多的差別。然而在一些特殊的實驗里，如雙標實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來 源的。有相應的驢來源的二抗，非常適合做類似雙標的免疫實驗?！径沟鸟盥?lián)標記】一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶(辣根過氧化酶HR閔口堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP PAP ,熒光基團(FITC、Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight 等)、生物素、金顆粒。選用哪種 探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于Western Blot和ELISA,最常用的二抗是酶標二抗；而細胞或組織標

9、記實驗(細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術)中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中 也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用 Biotin/Avidin 檢測系統(tǒng)。在一些熒光檢測方案中，則需要選擇不同的熒光標記；而金顆粒標記的二抗則 更多的應用于免疫電鏡中。艾美捷能為您提供上述所有不同類型標記的二抗?！臼欠窠?jīng)過血清吸附過的二抗】 為減少二抗與樣本的非特異性結合，艾美捷還能為您提供不同血清吸附的原裝進口二抗。如您的檢測樣本 是人源的蛋白，一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗就需要選擇抗小鼠源的二抗，如果您對實驗的特異性要 求很高，那我們向您推薦經(jīng)過人

10、血清吸附過的抗小鼠源的二抗，這種二抗由于經(jīng)過人血清吸附而排除了與 人源組織(如IgG等)可能發(fā)生非特異性反應的 IgG,因此將非特異性結合降低到最低。Anti-IgG 還是 Anti-IgG, F(ab)2 fragment 】在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細胞、淋巴細胞、B細胞等細胞內(nèi)，通常含有較多的Fc受體，這時候選擇二抗時最好選擇 Anti-IgG, F (ab)2 fragment這樣的特異性二抗，這樣就消除了由于Fc部分與IgG的非特異性結合。常規(guī)的 Anti-IgG(H+D二抗與IgG的重鏈和輕鏈都有結合反應，即與IgG的Fc的F (ab)2片段都能結合；由于IgG、IgM

11、、IgA都有保守的輕鏈結構域，因此 Anti-IgG(H+L)與它們都有交叉反應。而Anti-IgG, F(ab' ) 2 fragment經(jīng)過了 IgG Fc片段的吸附，因此只與IgG的F(ab') 2片段結合，然而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結構域，因此與它們也有交叉反應。Anti-IgG (H+L)、Anti-IgG (gamma、Anti-IgM(mu)、Anti-IgA (alpha)】在一些特殊的實驗里，只需要檢測樣本里的IgG或者IgM，常規(guī)的Anti-IgG(H+L)由于與IgG的重鏈和輕鏈都有結合反應，而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結構域，因此

12、不能特異性的檢測某種類型的IgG或者IgM。這時候就需要針對特殊類型Ig分子的二抗。艾美捷備有全面的二抗現(xiàn)貨產(chǎn)品并能提供最完整的二抗產(chǎn)品線。主要二抗品牌為全球最大的二抗產(chǎn)品以及前沿抗體生產(chǎn)商EarthOx。按照標記分，有 HRP AR生物素等標記二抗，F(xiàn)ITC、TRITC、Rhodamine、Cy3/5、Dylight等熒光二抗；按照檢測物種分，有抗人、 大鼠、小鼠、豬、驢、綿羊、山羊、小雞、馬、兔、倉鼠、狗、牛，以及多種細菌類二抗；另外，還有IgG、IgA、IgM以及IgG (Fc)、IgG (ab)2等不同類型抗體。如抗原為A C物質(zhì)，產(chǎn)生的抗體為抗-ac, 如抗原為B C物質(zhì)，產(chǎn)生的抗體

13、為抗-bc,AC物質(zhì)和抗-ac、BC物質(zhì)和抗-bc產(chǎn)生的是特異性結合， 而AC物質(zhì)和抗-bc、BC物質(zhì)和抗-ac就會產(chǎn)生交義反應.什么是抗體的交叉反應性呢看到有的抗體是小鼠來源的，但是跟人，大鼠，兔和猴子都有交叉反應性，什么是 抗體的交叉反應性呢？這樣的抗體可以用于人來源的細胞做western blot實驗嗎？抗原分子表面存在著能與抗體相互作用的部位即抗原決定簇，一種抗原物質(zhì)可以有兩個或更多的決定簇。研究表明，抗體是從抗原決定簇的立體結構而不是從抗原的全 面分子排列來“認識”抗原的。這樣，有時一種抗體可以與分子結構并不完全相同但 具有類似抗原決定簇的不同抗原起反應，這稱為交叉反應。如果你的抗體

14、和其它種屬 有交叉反應，理論上可以用于人源的WB哦，那如果廠家的產(chǎn)品說明上交叉反應性一欄里寫著人，大鼠，兔，猴，但是抗體來源是小鼠，是不是也就是說，這種抗體可以用于來源于人，大鼠，兔，猴的組織 或者細胞的WB可是為什么，買抗體的時候還要注意它的種屬和來源呢，我對這個 搞不清楚，希望指點，謝謝！所謂抗原和抗體的特異性結合其實也是相對的，抗原和抗體結合也就是十幾到二十 幾個氨基酸，理論上在其他的蛋白中也可能存在同樣或者相似的序列。其次至于抗體為什么能和不同種屬同一個分子反應，那是因為有一部分蛋白在機體 發(fā)揮較為重要的作用，因此可能在低等動物就存在，因此該分子的氨基酸序列存在 較為嚴格的保守性，也就是同樣的分子在不同種屬的序列是相同或者相似的，比如 VEGFFIo所以就出現(xiàn)免疫的時候是用人的抗原，但是后來產(chǎn)生的抗體