抑制消減雜交的原理及應用

1、主 要 內(nèi)內(nèi) 容 抑制消抑制消減雜減雜交的定交的定義義 抑制消抑制消減雜減雜交的基本原理及交的基本原理及實驗過實驗過程程 抑制消減雜減雜交的定義義抑制消減雜減雜交的原理是一種鑒定、分離組織細胞中選擇性表達基因的技術.其原理是以和為基礎的cDNA消減雜交技術.通過合成兩個不同的接頭，連接于測試cDNA片段的5末端，達到選擇性擴增差異性表達的cDNA片段，抑制非目的cDNA的擴增.該技術與其他消減雜交技術相比 假陽性率低、敏感性高、效率高等優(yōu)點而得到廣泛應用.抑制消減雜減雜交的原理 雜交二級動力學原理：雜交二級動力學原理：即豐度高的單鏈DNA在退火時產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA，從而使

2、原來在豐度上有差別的單鏈DNA相對含量達到基本一致。 抑制抑制PCR原理：原理：利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的特點，使非目的序列片段兩端反向重復序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補結構，無法作為模板與引物配對從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增。巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物，結合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異性

3、 巢式PCR示意圖抑制消減雜減雜交的原理抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程對于driver的ds cDNA只需經(jīng)Rsa I或Hac限制性內(nèi)切酶酶切成短片段，而不需添加接頭。分別向兩個tester樣品中加入過量的driver cDNA，于雜交緩沖液中進行雜交反應。第一輪雜交反應完畢后，將兩個tester樣品混合，再加入過量變性的driver cDNA繼續(xù)雜交反應。獲得作為PCR擴增模板的差異表達序列。 雜交產(chǎn)物中兩端連有不同接頭的片段就是所尋找的差異表達基因。經(jīng)補平末端后進行巢式PCR擴增以獲得所需要的差異表達基因。抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程消減文庫的克隆消減

4、文庫的克隆:經(jīng)巢式PCR擴增得到所需要的差異表達基因后，利用TA克隆法將差異表達基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，根據(jù)藍白斑篩選原理，篩選出轉(zhuǎn)化成功的陽性菌落。最后根據(jù)插入片段的兩端接頭引物進行巢式PCR反應對插入片段進行特異性擴增。PCR-TOPO 載體(T載體的一種)抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程 TA克隆構建原理克隆構建原理： TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆

5、位點（MCS）中。抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程 藍白斑篩選原理藍白斑篩選原理： 大腸桿菌（ -半乳糖苷酶缺陷型菌株）-半乳糖苷酶可分成2部分即肽段和C-段。肽段的基因位于載體上并含有不影響其ORF（open reading ）的多克隆位點（MCS），而C-段的基因位于工程菌E. coli DH5上。二者在同一菌株中表達時，菌株中的C-段與載體上的肽段互補而具有酶活性，能將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍。在MCS上插入新基因?qū)淖兤銸RF而使得載體上的肽段不能與菌株中的C-段互補而不能將無色化合物X-gal(5-溴-

6、4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍而產(chǎn)生白斑。選擇轉(zhuǎn)入的陽性克隆即選擇白斑。大腸桿菌大腸桿菌抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程藍白斑篩選示意圖抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程 定義：定義：確定單鏈核酸堿基序列的技術。其基本原理是待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過堿基配對形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術可在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同類型的雜交分子。人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交 抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程1.探針的制備探針是一段標記核酸序列，可與

7、靶序列互補形成雜交雙鏈，通過檢測雜交鏈信號即可對靶序列DNA的存在及其分子大小加以鑒別.探針可以是克隆的，也可以是合成的。用PCR擴增產(chǎn)物可制備探針。也可用提純的質(zhì)粒進行標記制備探針核酸核酸抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程探針種探針種類類 抑制消減雜減雜交雜雜交的實驗過實驗過程常見的為32P,它能量高信號強。放射性同位素具輻射 危害和半衰期限制。標記簡單，但是效率較低，對于短探針不宜使用。將生物素鏈接在核酸探針上，利用親和素對生物素有極高親和力的原理，分子雜交后用親和素或鏈酶親和素進行檢測生物素與dUTP中尿嘧啶的C5相連，在聚合酶作用下?lián)饺隓NA地高辛與UTP中尿嘧啶的C5相連。用熒光素標記

8、核酸；用熒光素標記抗生物素蛋白或抗地高辛抗體。 抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程 2核酸分子雜交方法的分類核酸分子雜交方法的分類抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程mRNA樣品經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與放射性標記樣品經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與放射性標記的的DNA探針進行雜交，經(jīng)放射自顯影，即可檢測特異性探針進行雜交，經(jīng)放射自顯影，即可檢測特異性mRNA分子分子在樣品中存在與否及其長度大小在樣品中存在與否及其長度大小斑點雜交是將斑點雜交是將DNA或或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上，然后樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上，然后與核酸探針分子雜交以顯示樣品中是否存在特異的與核酸探針

9、分子雜交以顯示樣品中是否存在特異的DNA或或RNA。利用類似利用類似Southern印跡法的方法對蛋白質(zhì)進行印跡分析，蛋白質(zhì)經(jīng)印跡法的方法對蛋白質(zhì)進行印跡分析，蛋白質(zhì)經(jīng)單向電泳分離后被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，然后用放射性或酶標記的單向電泳分離后被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，然后用放射性或酶標記的特異抗體來檢測相應抗原的存在。特異抗體來檢測相應抗原的存在。將DNA電泳轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針（DNA/DNA雜交）進行檢測的方法。是基因分離和鑒定的重要手段，廣泛用于遺傳多態(tài)性分析抑制消減雜減雜交的實驗過實驗過程將核酸點在能與核酸結合的膜（硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚偏氟乙烯膜等）上，經(jīng)80烘烤或紫外光照等處

10、理使核酸固定在膜上，然后與標記探針進行分子雜交，用放射自顯影或非放射性顯色檢測。并做定性或半定量分析。 斑點雜交點膜抑制消減雜減雜交技術術的優(yōu)優(yōu)點1234本技術對高、本技術對高、低豐度的差異低豐度的差異表達基因都能表達基因都能有效分離。主有效分離。主要原因是該技要原因是該技術利用了雜交術利用了雜交二級動力學原二級動力學原理理簡便易行及重簡便易行及重復性好：本技復性好：本技術所采用的方術所采用的方法簡單、成熟、法簡單、成熟、易掌握，易操易掌握，易操作，且假陽性作，且假陽性率低率低靈敏度高：用靈敏度高：用抑制消減雜交抑制消減雜交技術僅需要技術僅需要12ug的的mRNA快速：應用快速：應用這種方法一這種方法一般般34天即天即可獲得差異可獲得差異表達基因片表達基因片段的段的cD