微塑料（MPs）與氟苯尼考復(fù)合暴露對普通小球藻的毒性效應(yīng)研究

1、    微塑料（mps）與氟苯尼考復(fù)合暴露對普通小球藻的毒性效應(yīng)研究    高明宇 許曉路 張德勇【摘 要】對普通小球藻分別進行微塑料、氟苯尼考單獨染毒及聯(lián)合染毒96h，結(jié)果顯示藻類的增殖收到抑制，96h-ec50值分別為95.58 mg/l和22.82mg/l。染毒組藻類的葉綠素a含量降低、pod酶活力降低、mda含量升高。聯(lián)合染毒實驗則進一步顯示，微塑料與氟苯尼考復(fù)合暴露時，具有一定程度的拮抗效應(yīng)，其毒性效應(yīng)稍低于單獨染毒的毒性之和?！娟P(guān)鍵詞】微塑料，氟苯尼考，普通小球藻，淡水綠藻微塑料（microplastics，mps）指直徑小于5毫米的塑料碎片

2、和顆粒，是水體中的新型污染物。預(yù)計到2025年全球塑料的產(chǎn)量將達到330億噸，其環(huán)境污染問題日趨嚴(yán)重1。其中相當(dāng)大比例的塑料，在經(jīng)歷了一系列化學(xué)、物理的反應(yīng)和聯(lián)合作用，就變成體積更小，危害更大，處理難度也更大的mps。由于mps顆粒很小，于是很容易被水生生物誤食而攝入體內(nèi)，對其腸道或組織等造成損傷并影響其生長。mps可沿食物鏈傳遞，并對許多生物的生長、繁殖、免疫等產(chǎn)生不良影響。mps還可滲透磷脂雙分子層，影響細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運。ps-nh2能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)2 3，導(dǎo)致血細(xì)胞吞噬活性異常，還會改變細(xì)胞形態(tài)甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡4。藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者，處于食物鏈的底端同時容易受污染物的影響，其生

3、物量直接決定了食物鏈上游各級生物的維系，對生態(tài)系統(tǒng)至關(guān)重要。mps對藻類的毒性可為抑制細(xì)胞生長、降低葉綠素含量、引起細(xì)胞氧化損傷等，且毒性大小與微塑料的種類、大小、濃度等有關(guān)5-6。氟苯尼考作為良好的抗菌藥物，在養(yǎng)殖業(yè)中大量使用，并被排放到水體環(huán)境中，由于其半衰期長，因此可在水體中存在較長時間，是一種廣受關(guān)注的污染物。雖然這兩種污染物對藻類的單獨的毒性效應(yīng)已有不少研究，但是關(guān)于二者復(fù)合暴露時的復(fù)合效應(yīng)卻尚且罕有研究。實際上，單獨染毒不能反映實際情況，在實際環(huán)境中總是許多污染物共同存在時，會彼此影響，使得總體毒性的呈現(xiàn)十分復(fù)雜。因此，有必要進行復(fù)合毒性的研究，以深入了解環(huán)境污染物在實際情況中的復(fù)

4、雜效應(yīng)。對評價污染物對水體環(huán)境的危害具有重要的意義。1、材料與方法1.1 藻類培養(yǎng)及染毒方案微塑料采用聚乙烯（pe）粉末;普通小球藻（chlorella vulgaris）購自中科院水生生物所;“水生4號”培養(yǎng)基由所在實驗室配制;藻類培養(yǎng)條件為25、12h/12h光暗循環(huán)。單獨及聯(lián)合染毒的劑量方案見表1。藻類染毒后繼續(xù)培養(yǎng)96h并分析各指標(biāo)。1.2 藻類生物量的分析首先對藻液進行全波長掃描，找出特征吸收峰。然后分別利用吸光度法與顯微鏡計數(shù)法建立藻濃度與吸光度值之間的回歸方程。以吸光度作為分析藻類生物量的方法用于各指標(biāo)分析。1.3 藻類的生長抑制效應(yīng)分析及96h-ec50值計算基于a690值繪制

5、生長曲線，建立抑制率p和濃度的自然對數(shù)lnc的線性回歸關(guān)系，求解抑制率為50%的濃度值即ec50值。抑制率p（%）=（對照組a690-處理組a690）/對照組a690。1.4 葉綠素含量測定藻液用高速離心法提取，加1.5ml乙醇和少許石英砂研磨，轉(zhuǎn)入離心管定容到10ml，于4黑暗提取12h;4000rpm離心10min;上清于比色管中用90%乙醇定容10ml。于比色皿中，測吸光值。葉綠素a濃度（mg/l）=（11.64a633+2.16a645+0.10a630）v1/1000v2。式中v1為提取液定容體積（ml）;v2為濾液體積（l）。1.5 pod活性測定藻細(xì)胞破壁后，上清充分轉(zhuǎn)入25ml

6、容量瓶定容。取比色皿加入反應(yīng)混合液3 ml和酶液1 ml。立即開啟秒表記錄a470，每隔1min讀數(shù)1次，共5min。u=（a470×0. 01×w ×t）×樣品稀釋倍數(shù)。1.6 丙二醛（mda）活性測定藻液離心后加10%tca研磨，勻漿液12000rpm離心10min。取2ml上清于試管，加入0.6%硫代巴比妥酸2ml，沸水浴10min。4500rpm離心10min，取上清測吸光度。mda濃度=6.45（a532-a600）-0.56×a450。2、結(jié)果2.1 藻類增殖分析及96h-ec50值計算基于建立的吸光度法分析藻類增殖規(guī)律，經(jīng)計算，微

7、塑料、氟苯尼考對淡水綠藻的抑制率p（%）和濃度的自然對數(shù)（lnc）的線性回歸方程分別為：y=0.0633x+0.2111，r2=0.949;y=-0.4574x+19305，r2=0.9616。其96h-ec50值分別為95.58 mg/l和22.82mg/l。2.2 葉綠素含量如表1所示，單獨染毒mps、氟苯尼考均引起葉綠素含量下降，mps低劑量、高劑量組降幅分別為27.1%和36.5%;氟苯尼考組則分別為39.9%和44.6%。4個聯(lián)合染毒組的抑制率均低于相應(yīng)的單獨染毒組直接相加，故聯(lián)合染毒表現(xiàn)出拮抗效應(yīng)。2.3 pod的活性如表1所示，單獨染毒mps、氟苯尼考均引起pod活力下降，mps

8、低劑量、高劑量組降幅分別為16.7%和23.5%;氟苯尼考組則分別為48.0%和56.9%。4個聯(lián)合染毒組的降幅亦均低于直接單獨組的加和值，呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)。2.4 mda含量如表1所示，單獨染毒mps、氟苯尼考均引起mda值升高，mps低劑量、高劑量組升高率分別為0.25倍和0.41倍;氟苯尼考組則分別為2.3倍和2.6倍。4個聯(lián)合染毒組的抑制率均低于相應(yīng)的單獨染毒組直接相加，故聯(lián)合染毒表現(xiàn)出拮抗作用。3、結(jié)論現(xiàn)在微塑料已經(jīng)成為了全球性的問題，最近人們在珠穆拉瑪峰上檢測到了微塑料的存在，這也意味著人類在最深處馬里亞納海峽以及地球最高峰上都發(fā)現(xiàn)了微塑料的蹤跡，微塑料已成為不可忽視的問題。在2018

9、年的歐洲胃腸病學(xué)會議上，維也納的學(xué)者首次報告在人體排泄物中檢測到了多達9種mps，其直徑在50-500 ?m之間，每10克的糞便中就含有20個mps微粒。微塑料是一種造成污染的主要載體，代表著其不僅具有直接毒性，還可以于其他污染物結(jié)合，擴大污染范圍，他們之間的復(fù)合毒性效應(yīng)也亟待深入研究。本實驗中也證實微塑料自身毒性有限，毒性效應(yīng)不大，但與氟苯尼考聯(lián)合染毒時產(chǎn)生一定的協(xié)同作用，增強了氟苯尼考對于葉綠素、mda含量、pod等指標(biāo)的毒性。本實驗初步證明了mps與氟苯尼考單獨染毒均會影響藻類的增殖和生理指標(biāo);復(fù)合染毒時，葉綠素、mda含量、pod活力等指標(biāo)表現(xiàn)出的毒性效應(yīng)多數(shù)弱于單獨染毒直接相加的總合

10、，故可認(rèn)為符合染毒具有一定的拮抗效應(yīng)。拮抗效應(yīng)的機制可能與微塑料具有一定的吸附效應(yīng)有關(guān)。本研究初步證實了mps對于藻類有著毒性效應(yīng)，多種污染物同時作用于藻類時，其呈現(xiàn)的現(xiàn)象是比較復(fù)雜的。mps的毒性機制可以破壞藻類光合作用、抗氧化能力等，但是還有許多內(nèi)容有待進一步的研究。參考文獻：1楊杰，李連禎，周倩，李瑞杰，涂晨，駱永明.土壤環(huán)境中微塑料污染：來源、過程及風(fēng)險j/ol.土壤學(xué)報：1-182020-11-24.2lnnstedt om，eklv p. environmentally relevant concentrations of microplastic particles influe

11、nce larval fish ecologyj. science. 2016，352（6290）：1213-1216.3avio cg，gorbi s，milan m，et al. pollutants bioavailability and toxicological risk from microplastics to marine musselsj. environmental pollution. 2015，198：211-222.4collard f，gilbert b，compère p，et al. microplastics in livers of europea

12、n anchovies（engraulis encrasicolus，l.）j. environmental pollution. 2017，229：1000-1005.5zhang c，chen xh，wang jt，et al. toxic effects of microplastic on marine microalgae skeletonema costatum：interactions between microplastic and algae j. environmental pollution，2017，220：1282-12886sjollema sb，redonda-h

13、asselerp，leslie ha，et al. do plastic particles affect microalgal photosynthesis and growth j. aquatic toxicology，2016，170：259-2617mao yf，ai hn，chen y，et al. phytoplankton response to polystyrene microplastics：perspective from an entire growth periodj. chemosphere，2018，208：59-68作者簡介：高明宇，1998.10.8，男，漢，浙江杭州，工作單位：浙江樹人大學(xué)在讀大學(xué)生，研究方向：環(huán)境工程。許曉路，1966.4，男，漢，浙江金華，碩士，教授，研究方向：生態(tài)毒理。張德勇，1978.4，男，漢，山東聊城，博士，教授，研究方向：生物工程。致謝：本課題