細(xì)胞無(wú)菌檢測(cè)通則-編制說(shuō)明

1、細(xì)胞無(wú)菌檢測(cè)通則國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明（征求意見(jiàn)稿）一、工作簡(jiǎn)況1、任務(wù)來(lái)源本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)2018 年第四批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃，項(xiàng)目編號(hào)“ 20184461-T-469”。本項(xiàng)任務(wù)由全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/ TC 387）提出并歸口，定于2019 年完成。2、制定標(biāo)準(zhǔn)背景和目的細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞研究中最基本的實(shí)驗(yàn)。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)的重要作用越發(fā)突顯。 在生命科學(xué)的許多領(lǐng)域，細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)的可靠性也越發(fā)重要。體外細(xì)胞培養(yǎng)提供了一種環(huán)境，在這種環(huán)境中，即使是非常挑剔的生物體，包括病毒，也可能生長(zhǎng)和復(fù)制，從而接受此類(lèi)污染制劑的任何患者的生物檢測(cè)或感染提供了

2、潛在的干擾。微生物污染通常是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中最常見(jiàn)的問(wèn)題，這可能造成災(zāi)難性的細(xì)胞死亡，也可能維持在較低水平(有時(shí)由于使用抗生素)，并影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。這些污染物可能包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒和其他類(lèi)型的生物體，其中一些物種可以在特定的細(xì)胞培養(yǎng)條件下存活。因此， 有必要通過(guò)充分了解污染源和在細(xì)胞培養(yǎng)和使用前通過(guò)良好的檢測(cè)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)微生物污染。檢測(cè)每一種生物制劑的方法有很多，對(duì)于我們應(yīng)該選擇哪種方法以及如何檢測(cè)缺乏明確的指導(dǎo)。因此，我們對(duì)干細(xì)胞培養(yǎng)物中微生物的檢測(cè)提出一般性的指導(dǎo)原則，希望能為細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中微生物污染的檢測(cè)提供參考。針對(duì)不同來(lái)源微生物的鑒定方法及原理不盡相同，并且各具特色。3、標(biāo)準(zhǔn)制

3、定工作過(guò)程（ 1） 2017 年 5 月，開(kāi)始調(diào)研細(xì)胞微生物檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)針對(duì)細(xì)胞的檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)是缺乏的。（ 2） 2017 年 7 月在北京召開(kāi)討論會(huì)，就細(xì)胞無(wú)菌檢測(cè)通則標(biāo)準(zhǔn)的必要性進(jìn)行了討論，確定了該標(biāo)準(zhǔn)的必要性。（ 3） 2017 年 9 月，于干細(xì)胞生物學(xué)分會(huì)標(biāo)準(zhǔn)工作組內(nèi)討論了細(xì)胞無(wú)菌檢測(cè)通則標(biāo)準(zhǔn)的草案的框架。（ 4） 2019 年 2 月 26 日，于干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)工作組2019 年第一次會(huì)議，與標(biāo)準(zhǔn)工作組專(zhuān)家對(duì)草案進(jìn)行溝通。1（ 5） 2019 年 5 月 14 日，于干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)工作組2019 年第 2 次會(huì)議，與標(biāo)準(zhǔn)工作組專(zhuān)家繼續(xù)溝通了細(xì)胞無(wú)菌檢測(cè)通則標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容。（ 6）2019

4、 年 9 月 19 日，召開(kāi)了干細(xì)胞生物學(xué)分會(huì)標(biāo)準(zhǔn)工作組年會(huì)，對(duì)細(xì)胞無(wú)菌檢測(cè)通則標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容做了進(jìn)一步完善。（ 7） 2019 年 10 月形成細(xì)胞無(wú)菌檢測(cè)通則征求意見(jiàn)稿。二、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)起草完全遵守GB/T 1.1-2009 標(biāo)準(zhǔn)化工作指導(dǎo)第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)的規(guī)則進(jìn)行編寫(xiě)。本標(biāo)準(zhǔn)以促進(jìn)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)內(nèi)基于細(xì)胞培養(yǎng)的微生物檢測(cè)工作的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化為出發(fā)點(diǎn)， 以技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)必須具有廣泛性、 可操作性和適用性為工作目標(biāo)， 參考了現(xiàn)有微生物檢測(cè)相關(guān)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)內(nèi)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、指導(dǎo)文件和科研文獻(xiàn)，系統(tǒng)總結(jié)出了各檢測(cè)方法及特點(diǎn)，為用戶(hù)的選擇提供參考，滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)制定的通用性，普適性和先

5、進(jìn)性要求。在本次標(biāo)準(zhǔn)研究制定過(guò)程中，廣泛參考了以下標(biāo)準(zhǔn)文件。序號(hào)類(lèi)型（文獻(xiàn)、專(zhuān)利、名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)）1標(biāo)準(zhǔn)ISO/ TS 11139:2006醫(yī)療保健產(chǎn)品的滅菌- 詞匯ISO/ TS 22442-3:20072標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療設(shè)備用動(dòng)物組織及其衍生物- 第三部分： 病毒和傳染性海綿狀腦?。═SE）ISO/DIS20391-1:20173標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù) - 細(xì)胞計(jì)數(shù) - 第 1 部分：細(xì)胞計(jì)數(shù)的一般指導(dǎo)三、標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容1、細(xì)胞中無(wú)菌檢測(cè)方法選擇1.1 真菌和細(xì)菌方法檢測(cè)對(duì)象 / 注意事項(xiàng)膜過(guò)濾法大體積的細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)菌和真菌檢測(cè)直接培養(yǎng)法活的細(xì)菌和真菌2微生物代謝產(chǎn)物的放射檢測(cè)活的細(xì)菌和真菌革蘭氏染色法活的或死的

6、細(xì)菌和真菌16S RNA PCR 法存在于活的或死的細(xì)胞中，或游離于上清液中的核酸傅里葉變換紅外光譜學(xué)活的或死的細(xì)菌和真菌氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用死細(xì)菌或真菌多糖中的脂肪酸、單糖和熊果酸革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖凝膠法結(jié)果取決于鱟試劑的靈敏度。革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖濁度法濁度法不能用于某些混濁或有色產(chǎn)品。革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖比色測(cè)定比色法不能用于某些混濁或有色產(chǎn)品。革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖顯色試驗(yàn)顯色法不能用于某些混濁或有色產(chǎn)品。重組 C 因子法革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖該方法能有效避免假陽(yáng)性。熱原質(zhì)試驗(yàn)所有種類(lèi)的能導(dǎo)致動(dòng)物體溫升高的內(nèi)毒素。內(nèi)毒素廣泛存在于細(xì)菌中，包括革蘭氏陽(yáng)性菌和單核細(xì)胞活化試驗(yàn)革蘭氏陰性菌。1

7、.2 病毒方法檢測(cè)對(duì)象 / 注意事項(xiàng)核酸的方法存在于活細(xì)胞、死細(xì)胞或游離于上清液中的特定病毒的核酸基于免疫分析的方法特定的病毒抗原。在細(xì)胞或培養(yǎng)上清中的活的和死的病毒結(jié)構(gòu)。可采用不同的技術(shù)如下 :光學(xué)顯微鏡檢查細(xì)胞培養(yǎng)的病變。顯微鏡熒光顯微鏡檢測(cè)病毒抗原。透射電鏡觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)病毒。掃描電鏡觀(guān)察細(xì)胞表面病毒顆粒。紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)用紅細(xì)胞接種到受感染用于檢測(cè)可以引起紅細(xì)胞凝集的病毒抗原或活病毒顆粒。3的細(xì)胞培養(yǎng)物上動(dòng)物接種能引起動(dòng)物病理效應(yīng)的活病毒。雞胚接種可感染雞胚的不同組織的活病毒。接種動(dòng)物細(xì)胞系活病毒，引起細(xì)胞病變或表達(dá)可檢測(cè)的病毒抗原。1.3 支原體方法檢測(cè)對(duì)象 / 注意事項(xiàng)在肉湯和固體瓊脂培

8、養(yǎng)基中培養(yǎng)支活的、可培養(yǎng)的支原體。原體示蹤細(xì)胞培養(yǎng)法(DNA 染色 )適用于各種支原體。核酸擴(kuò)增法用特異性引物檢測(cè)特異性支原體。DNA 染色用于檢測(cè)不能在選擇性培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的支原體菌株。支原體特異性酶的檢測(cè)本方法檢測(cè)支原體特異性酶。2、細(xì)胞無(wú)菌檢測(cè)過(guò)程影響因素基于干細(xì)胞微生物的種類(lèi)及來(lái)源為多個(gè)，一般包括：真菌、細(xì)菌、病毒及支原體。我們對(duì)每種來(lái)源的微生物檢測(cè)方法提出了要求。同時(shí)對(duì)樣本制備環(huán)節(jié)及檢測(cè)過(guò)程中注意考慮的環(huán)節(jié)提出了要求2.1 微生物檢測(cè)樣本的制備對(duì)于不同微生物檢測(cè)所需的樣本制備，目前無(wú)通用方法，需針對(duì)不同細(xì)胞，不同來(lái)源微生物及不同實(shí)驗(yàn)方法選擇合適的制備方法。但是對(duì)于制備過(guò)程中

9、的質(zhì)量有共性要求，因此我們對(duì)其中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。包括以下幾點(diǎn)：抽樣應(yīng)說(shuō)明抽樣方法，包括待測(cè)物品的數(shù)量、體積和大小。微生物檢測(cè)過(guò)程可能需要在檢測(cè)前準(zhǔn)備樣品，應(yīng)考慮其對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響。在樣品制備過(guò)程中應(yīng)始終保持無(wú)菌條件，此外，測(cè)試環(huán)境必須滿(mǎn)足無(wú)菌測(cè)試環(huán)境的任何特定法規(guī)要求。防止污染的措施不應(yīng)影響檢測(cè)產(chǎn)品中微生物的檢測(cè)。膜過(guò)濾法通常取混合細(xì)胞培養(yǎng)基上清液至少10ml。樣品制備過(guò)程的某些方面，如環(huán)境因素、程序和試劑，可能會(huì)在微生物檢測(cè)中引入可變性，在報(bào)告結(jié)果時(shí)應(yīng)予以考慮。4樣品必須與被測(cè)材料相適應(yīng)，至少要考慮到：1）成品批次的大小和體積；2）樣品的生產(chǎn)期限；3）最終容器配置及尺寸；4）被檢測(cè)物

10、質(zhì)中含有的抑制劑、中和劑、防腐劑的數(shù)量或者濃度；5）以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的試驗(yàn)方法，供試品的體積使產(chǎn)物稀釋而不具有抑菌或抑菌作用；6）對(duì)于非培養(yǎng)的檢測(cè)方法，供試品的體積使產(chǎn)物稀釋但不抑制或以其他方式阻礙對(duì)微生物污染的檢測(cè)。樣本儲(chǔ)存應(yīng)根據(jù)樣本材料可能的穩(wěn)定性考慮樣品儲(chǔ)存條件。特別是在支原體檢測(cè)的基礎(chǔ)上;包裝后 24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)支原體，可在 2-8保存。但是，如果儲(chǔ)存超過(guò)24 小時(shí)，則應(yīng)保持在 -20以下（中國(guó)藥典 ；Food and Drugs PART610.30 Test for Mycoplasma）。環(huán)境因素應(yīng)盡量減少影響細(xì)胞微生物檢測(cè)的環(huán)境因素（如溫度峰值）。環(huán)境因素可能包括溫度、濕度、光照、

11、無(wú)菌條件和氣流。任何用于無(wú)菌檢查的溶液、稀釋或沖洗劑，如果要用作微生物檢測(cè)的測(cè)試樣品，則不應(yīng)具有抗菌特性。測(cè)試程序必要時(shí)，應(yīng)考慮設(shè)備和試劑對(duì)微生物檢測(cè)的影響。應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臉悠诽幚砣萜?，以免造成微生物或化學(xué)污染或以其他方式影響結(jié)果。測(cè)試的關(guān)鍵要素包括樣品批號(hào)、日期、操作人員和使用的質(zhì)控物，都應(yīng)文件化。對(duì)于測(cè)試的關(guān)鍵方面或中間階段的任何偏差或非預(yù)期結(jié)果都應(yīng)與測(cè)試結(jié)果一起記錄。試劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性樣品制備中使用的試劑應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，以確保質(zhì)量和一致性。試劑的質(zhì)量應(yīng)通過(guò)檢查供應(yīng)商提供的詳細(xì)資料（例如分析證書(shū)） ，并在必要時(shí)使用補(bǔ)充方法和 / 或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加以驗(yàn)證。有些試劑在一定的時(shí)間或環(huán)境條件下可能不穩(wěn)定。試

12、劑的貯存和微生物檢驗(yàn)應(yīng)在試劑的可接受的穩(wěn)定性范圍內(nèi)進(jìn)行。容器5樣品容器相對(duì)于樣品尺寸適宜，避免蒸發(fā)、無(wú)菌、無(wú)毒、無(wú)浸出。樣品容器應(yīng)無(wú)菌，并滿(mǎn)足任何其他相關(guān)要求。依據(jù)檢測(cè)的目的，它可能需要滿(mǎn)足適用的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)。Food and Drug, part 6 10.12 sterility2.2 微生物檢測(cè)試驗(yàn)環(huán)節(jié)真菌和細(xì)菌（藥典2015 版通則 1101 無(wú)菌微生物檢查法）細(xì)菌內(nèi)毒素（藥典2015 版通則 1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法）病毒（藥典2015 版通則 3302-外源病毒因子檢查法）支原體（藥典2015 版通則 3301-支原體檢查法）3、主要檢測(cè)方法特點(diǎn)各方法特點(diǎn)如下：微 生 物分類(lèi)方法耗時(shí)

13、精 確 度靈敏度操 作 復(fù)建 立 難廣譜性類(lèi)別或 特 異雜度易度性細(xì) 菌 及直接鏡檢法直接鏡檢法快速低低簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單高真菌基于培養(yǎng)的膜過(guò)濾法14 天高高簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單高方法直接培養(yǎng)法14 天高高簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單高基于核酸的16S RNA PCR法當(dāng)天高高較復(fù)雜較難高方法基于代謝產(chǎn)氣相色譜 - 質(zhì)譜快速高高簡(jiǎn)單復(fù)雜高物的方法聯(lián)用基于微生物革蘭氏染色法時(shí)間短高高簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單高組分傅里葉變換紅外快速高高簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單高光譜學(xué)內(nèi)毒素基于鱟試劑凝膠法快速高高簡(jiǎn)便快速高的方法濁度法快速高高簡(jiǎn)便快速高顯色試驗(yàn)快速高高復(fù)雜快速高重組 C因子重組 C 因子法低較高簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單低法熱原質(zhì)試驗(yàn)熱原質(zhì)試驗(yàn)周期長(zhǎng)低低復(fù)雜復(fù)雜高單核細(xì)胞活單核細(xì)胞活化試

14、2 天低低簡(jiǎn)單復(fù)雜高化試驗(yàn)驗(yàn)病毒核酸的方法PCR、實(shí)時(shí) PCR、2 小時(shí)高高簡(jiǎn)單較難高逆轉(zhuǎn)錄 PCR和巢式 PCR高通量測(cè)序和基快速高高較難較難高因芯片技術(shù)6逆轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)方快速高高復(fù)雜較難低法基于免疫分紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)快速高高簡(jiǎn)便簡(jiǎn)單低析的方法酶聯(lián)免疫法當(dāng)天較高較高簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單低免疫熒光法快速高高簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單低抗體生成法時(shí)間較低低簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單中長(zhǎng)顯微鏡直接光學(xué)顯微鏡、熒快速直高高較難較難高觀(guān)察法光顯微鏡、共聚接焦顯微鏡（CFM）、透射電鏡（ TEM）和掃描電鏡（SEM）基于接種的動(dòng)物接種耗時(shí)較低高較難較難高方法長(zhǎng)雞胚接種耗時(shí)較高高簡(jiǎn)便簡(jiǎn)單較高長(zhǎng)接種動(dòng)物細(xì)胞系耗時(shí)較低低繁瑣較難較低長(zhǎng)支原體基于培養(yǎng)的培養(yǎng)法28

15、-35高高繁瑣簡(jiǎn)單較高方法天示蹤細(xì)胞培養(yǎng)法比培養(yǎng)高高繁瑣難高(DNA 染色 )法快基于核酸的核酸擴(kuò)增法3h高高簡(jiǎn)單較難低方法基于特異性支原體特異性酶2h高高簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單高酶的方法的檢測(cè)原蟲(chóng)涂片顯微鏡觀(guān)察當(dāng)天高高簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單高四、采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度本標(biāo)準(zhǔn)未采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)， 本標(biāo)準(zhǔn)在制定過(guò)程中未查到同類(lèi)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。 本標(biāo)準(zhǔn)未采用國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，本標(biāo)準(zhǔn)在制定過(guò)程中未查到針對(duì)性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)。五、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)與相關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章及強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致，沒(méi)有沖突。六、重大分歧意見(jiàn)的處理和依據(jù)7無(wú)。七、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)作為國(guó)家強(qiáng)制性或推薦性的建議為了保證我國(guó)細(xì)胞生物產(chǎn)業(yè)的技術(shù)進(jìn)步與行業(yè)規(guī)范發(fā)展，為相關(guān)基礎(chǔ)科研和實(shí)際應(yīng)用提供有力的技術(shù)和產(chǎn)品保證，建議本標(biāo)準(zhǔn)作為國(guó)家推薦性標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施。八、貫徹國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議細(xì)胞微生物檢測(cè)是在生物產(chǎn)業(yè)和相關(guān)基礎(chǔ)研究中最為基本的技術(shù)活動(dòng)之一，應(yīng)用廣泛，意義深遠(yuǎn)。發(fā)達(dá)國(guó)