乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書微量法

1、北京索萊寶科技有限公司Solarbio®LIFE SCIENCES第1頁(yè)，共3頁(yè)北京索萊寶科技有限公司第#頁(yè)，共3頁(yè)北京索萊寶科技有限公司乳酸脫氫酶(LDH活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書微量法注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。貨號(hào)：BC0685規(guī)格：100T/48S產(chǎn)品內(nèi)容：提取液：液體60mLXl瓶，4C保存；試劑一：液體7 mLXl瓶，4C保存；試劑二：粉劑X1支，-20 C保存，用時(shí)加入 1.3 mL雙蒸水充分溶解備用，配好后可分裝成小管-20 C 保存，可保存兩周，禁止反復(fù)凍融；試劑三：液體7 mLXl瓶，4C保存；試劑四：液體25 mL<1瓶，4C保存

2、；丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液：液體 1 mbl支，4C保存，2卩mol/ml。產(chǎn)品簡(jiǎn)介：LDH(EC 1.1.1.27 )廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙 酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著NAD/NADH之間互變。LDH催化NAD氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與2, 4 -二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。操作步驟：、粗酶液提取:第2頁(yè)，共3頁(yè)北京索萊寶科技有限公司e Solarbio

3、®LIFE SCIENCES1. 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（ml）為5001000: 1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì) 胞（冰浴，功率 20滅 200W超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次）；8000g 4C離心10min,取上清，置冰上待 測(cè)。組織：按照組織質(zhì)量（g）:提取液體積（mL）為 1： 510的比例（建議稱取約 0.1g組織，加入1mL提 取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4C離心10mi n,取上清，置冰上待測(cè)。2. 血清（漿）樣品：

4、直接檢測(cè)。3. 丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液：取 100譏標(biāo)準(zhǔn)液，倍比稀釋至 1、0.5、0.25、0.125、0卩mol/mL,用 2、1、0.5、0.25、0.125、0卩 mol/mL 做標(biāo)準(zhǔn)曲線。二、測(cè)定操作表：1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm蒸餾水調(diào)零。2. 樣本測(cè)定試劑名稱（卩L）測(cè)定管對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)管待測(cè)樣本1010-標(biāo)準(zhǔn)液-10試齊寸一505050試劑二10-蒸餾水-1010充分混勻，37C（哺乳動(dòng)物）或 25C（其它物種）準(zhǔn)確水浴 15min試劑三505050充分混勻，37C（哺乳動(dòng)物）或 25C（其它物種）水浴 15mi n試劑四150150150充分混勻，室

5、溫靜置 3min,取200 L轉(zhuǎn)移至微量玻璃比色皿或在 96孔板中，450 nm下測(cè)定吸光度,計(jì)算 A=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照。第3頁(yè)，共3頁(yè)北京索萊寶科技有限公司e Solarbio®LIFE SCIENCES根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定值和濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，y為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，卩mol/mL;x為對(duì)吸光度（減去濃度為 0的標(biāo)準(zhǔn)管的0D直）。LDH活力單位計(jì)算：1. 計(jì)算樣品丙酮酸的含量，即將AA帶入回歸方程中（x），計(jì)算y值2. 血清（漿）LDH活力的計(jì)算單位的定義：每 mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生Inmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。3LDH（U/mL） =yXV 樣+ V

6、樣十 TX 10 =66.7 Xy3. 細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 LDH活力的計(jì)算（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH （U/mg prot ） = y XV 樣+（ CprXV 樣）十 TX 10 3=66.7 X y+ Cpr需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。（2）按樣本鮮重計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH（ U/g 鮮重）=y XV 樣+（ WV 樣總XV 樣）十 TX 103=66.67 X y-W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH（U/104 cell ）= yXV 樣-（500-V 樣總XV 樣）十 TX 10 3=0.133 XyV樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，10卩L=0.01mL;V樣總：加入的提取液體積，1mLT：反應(yīng)時(shí)間，15 min;Cpr:蛋白質(zhì)濃度，mg/mLW