轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)甲胎蛋白（課堂PPT）

1、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)第四次討論課第四次討論課醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)AFP的來源及生化特性AFP測(cè)定的臨床意義從轉(zhuǎn)錄水平對(duì)AFP（甲胎蛋白）基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)AFP的來源及生化特性的來源及生化特性甲種胎兒球蛋白（alpha-fetoprotein或-fetoprotein,AFP或afp）。AFP是嚙齒類動(dòng)物胚胎期和人胚胎期血清中的主要蛋白成分。人類胚胎在宮內(nèi)發(fā)育的第六周左右用雙向擴(kuò)散法即能測(cè)出AFP，到第13周左右可達(dá)到高峰，第16周后AFP的濃度迅速下降而白蛋白濃度上升。在人類胚胎中AFP最高濃度可達(dá)34mg/ml，但新生兒期其血清濃度約為1050ug/ml，出生后第1周末用雙向擴(kuò)散法即不再

2、能測(cè)出，然而用敏感的方法測(cè)定，證明AFP可持續(xù)存在于正常成人的血清中。AFP的合成部位主要是在嚙齒動(dòng)物及人類胚胎的肝臟，但也可在卵黃囊及胃腸道等。人類的AFP屬于球蛋白，分子量約為64,00072,000。此蛋白約有18種氨基酸組成，碳水化合物約占4%。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)AFP測(cè)定的臨床意義測(cè)定的臨床意義診斷原發(fā)性肝癌。檢測(cè)AFP的含量是診斷原發(fā)性肝癌的重要手段之一，由于肝癌的癌細(xì)胞能合成或分泌較多的AFP釋放入血的緣故。正因?yàn)槿绱?，醫(yī)生們就把檢測(cè)人體血液中的AFP作為診斷肝癌的重要依據(jù)，并把AFP稱為“肝癌標(biāo)志物”。檢測(cè)AFP是診斷肝癌的一種簡(jiǎn)便、靈敏、快捷的方法，現(xiàn)認(rèn)為它在發(fā)現(xiàn)早期肝癌方面有獨(dú)

3、一無二的價(jià)值，用AFP診斷肝癌的“專一性”僅次于病理學(xué)檢查。血清AFP升高，還可出現(xiàn)于畸胎瘤、睪丸和卵巢腫瘤等。急性肝炎和肝硬化的鑒別診斷肝細(xì)胞再生時(shí)期，AFP在血液中呈陽(yáng)性，急、慢性肝炎、肝硬化時(shí)會(huì)有肝細(xì)胞再生，因而AFP在血液中的濃度升高。一般急性肝病，可隨病情好轉(zhuǎn)AFP含量下降或正常，肝硬化可呈下降或持續(xù)低水平，肝癌則逐漸上升。先天性疾病的診斷先天性疾病的診斷：檢測(cè)羊水中AFP含量的意義已引起注意，Rendle用放射免疫法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無腦兒羊水中含量顯著升高。正常妊娠1216周羊水AFP含量為21.11.2mg/L，以后逐月下降，足月時(shí)為0.50.2mg/L。無腦兒患者在妊娠2631周為9

4、5.719.3mg/L，32-38周為25.75.9mg/L。先天性腎病及脊柱裂也有類似報(bào)道。因此用放免法檢測(cè)羊水中AFP含量，有助于某些先天性疾病的出生前診斷。母體血中AFP升高還可見于異常妊娠，如：胎兒有脊柱裂、無腦兒、腦積水、十二脂腸和食道閉鎖、腎變性、胎兒宮內(nèi)窒息、先兆流產(chǎn)和雙胎等。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)甲胎蛋白基因甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP) 的異常表達(dá)與肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤有關(guān)的異常表達(dá)與肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤有關(guān)。01020304實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)方法及原理技術(shù)路線 可能的結(jié)果分析及應(yīng)用從從轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄水平對(duì)水平對(duì)AFP（甲胎蛋白）（甲胎蛋白）基因基因的表達(dá)進(jìn)

5、行檢測(cè)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募夹g(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理可能的結(jié)果分析及應(yīng)用 肝癌細(xì)胞的血源性播散是原發(fā)性肝癌肝外轉(zhuǎn)移的主要方式，定量檢測(cè)AFP(alphafetoprotein)mRNA可早期發(fā)現(xiàn)外周血的肝癌細(xì)胞，不僅對(duì)判斷肝癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)具有重要價(jià)值，而且對(duì)指導(dǎo)臨床制定治療措施亦有重要意義。 通過提取肝癌病人的外周血，根據(jù)mRNA豐度的測(cè)定方法，從轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄水平對(duì)AFP（甲胎蛋白）基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 取材：肝癌患者外周血，用健康志愿者與非癌性肝病患者作為對(duì)照組。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用通過細(xì)胞RNARNA提取提取技術(shù)，然后通過逆轉(zhuǎn)錄合成逆轉(zhuǎn)錄

6、合成cDNAcDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR技術(shù)，測(cè)定AFPmRNA的豐度。實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一）是一種在種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)骄酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。Real-timePCR是在是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號(hào)，對(duì)擴(kuò)增過程中，通過熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，通過內(nèi)參值和該

7、模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，通過內(nèi)參或者外參法可對(duì)待測(cè)樣品中的特定或者外參法可對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析序列進(jìn)行定量分析。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用一、實(shí)時(shí)熒光定量一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ-PCR）01熒光染料02熒光共振能量轉(zhuǎn)移03PCR擴(kuò)增及其監(jiān)測(cè)04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理05實(shí)時(shí)熒光定量PCR優(yōu)缺點(diǎn)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用 熒光基團(tuán)通常各有單一的的光吸收峰，熒光基團(tuán)吸收激發(fā)光的能量后通常以3種方式釋放出能量。 （1）光能 （2）熱能 （3）轉(zhuǎn)移給鄰近的分子01熒光染料醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路

8、線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用 當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長(zhǎng)（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）的熒光基團(tuán)，實(shí)際相當(dāng)于將短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽（猝滅）。02熒光共振能量轉(zhuǎn)移醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用 熒光PCR的獨(dú)特之處在于PCR過程中利用熒光染料在激發(fā)光下釋放的熒光能量的變化直接反應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。由于熒光信號(hào)變量與擴(kuò)增產(chǎn)物變量成正比，通過足夠靈敏的自動(dòng)化儀器對(duì)熒光進(jìn)行采集和分析，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)PCR過程的檢測(cè)，達(dá)到對(duì)原始模板定量的目的，主要采用以下數(shù)種

9、模式：03PCR擴(kuò)增及其監(jiān)測(cè)01仿溴乙錠著色監(jiān)測(cè)02熒光標(biāo)記引物03熒光標(biāo)記探針醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理1.幾個(gè)基本概念01020304基線熒光閾值的設(shè)定Ct值值05S型擴(kuò)增曲線型擴(kuò)增曲線熔解曲線醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大。接近一條直線，這樣的直線即是基線。一般將PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（本底信號(hào)是指沒有進(jìn)樣時(shí)檢測(cè)器的信號(hào)值，與檢測(cè)器的類型有關(guān)，是無論如何也去不掉的值。測(cè)試的結(jié)果是在本底值之上增加多少的），熒光

10、域值是PCR315個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理基線熒光閾值的設(shè)定C代表循環(huán)數(shù)、t代表域值。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，而所涉閾值都很低。Ct值分析實(shí)際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，誤差沒有被放大，所以具有良好的重現(xiàn)性。Ct值值醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所作的曲線。S型擴(kuò)增曲線型擴(kuò)增曲線04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)

11、果分析及應(yīng)用 Ct與起始模板量的對(duì)數(shù)呈反比，即Y=-aX+b，其中X為濃度值對(duì)數(shù)值，Y 為Ct值。 PCR擴(kuò)增包含定量對(duì)照，即引入一系列已知起始濃度的模板與未知樣品同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，配合使用PCR擴(kuò)增與熒光檢測(cè)合二為一的儀器，利用該系列模板Ct值與已知濃度對(duì)數(shù)作直線回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出位置樣品的起始模板濃度。 這種定量分析摒棄對(duì)PCR終產(chǎn)物的測(cè)定，通過監(jiān)測(cè)PCR過程中熒光強(qiáng)度的連續(xù)變化，用準(zhǔn)確表征PCR對(duì)數(shù)增長(zhǎng)規(guī)律的Ct值進(jìn)行循環(huán)實(shí)時(shí)分析。04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用 固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號(hào)與模板數(shù)成正比，但當(dāng)固定熒光信號(hào)值

12、后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)呈反比。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線：橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得位置樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)（起始拷貝數(shù)就是指某基因(可以是質(zhì)粒)在某一生物的基因組中的個(gè)數(shù).單拷貝就是該基因在該生物基因組中只有一個(gè),多則指有多個(gè)）。04實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量原理醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用熒光PCR融匯了PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)的定量精確性，具有以下的優(yōu)點(diǎn)：05實(shí)時(shí)熒

13、光定量PCR優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)1）封閉反應(yīng)，直接探測(cè)PCR過程中的變化以獲得定量的結(jié)果，污染因素少，且無需PCR后處理。2）靈敏度高，假陽(yáng)性率低，熒光標(biāo)記探針的最大優(yōu)點(diǎn)在于其特異性非常強(qiáng)，避免了非特異性擴(kuò)增造成的假陽(yáng)性信號(hào)。3）采用對(duì)數(shù)期分析，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，定量準(zhǔn)確。7）操作安全快速4）定量范圍寬，可達(dá)到10個(gè)數(shù)量級(jí)。5）計(jì)算機(jī)同步跟蹤，數(shù)據(jù)化自動(dòng)處理，在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，結(jié)果直觀，避免人為判斷。8）利與自動(dòng)化和聯(lián)網(wǎng)管理6）效率高，可用多種商品畫熒光物質(zhì)，如TET、FAM、HEX、JOE等作為報(bào)告熒光（3端的猝滅基團(tuán)常用TAMRA），實(shí)現(xiàn)一管雙檢或多檢。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果

14、分析及應(yīng)用擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)越靠后，定量的重復(fù)性越差，可能有以下主要原因：1)熒光定量技術(shù)要求在低分子濃度環(huán)境。因?yàn)闊晒鈾z測(cè)定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立起來的。如果分子濃度過高，影響作用復(fù)雜，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)高濃度的，因此重復(fù)性變差也很容易理解。2)由于擴(kuò)增末期，擴(kuò)增效率可能因?yàn)榇罅康陌行蛄卸a(chǎn)生不可控的影響。05實(shí)時(shí)熒光定量PCR優(yōu)缺點(diǎn)缺點(diǎn)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用二、二、TaKaRa One Step SYBR QRT-PCR試劑盒試劑盒醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用01制品內(nèi)容醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法

15、及原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡艿慕Y(jié)果分析及應(yīng)用原理：原理：本制品利用反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptRTase將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在以cDNA為模板利用TaKaRaExTaqHS在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)（利用SYBRGreenI嵌合熒光法）。采用如圖所示的OneStepRT-PCR方法，反轉(zhuǎn)錄以總RNA為模板，利用反應(yīng)引物合成cDNA，在以此為模板，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。01制品原理醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募夹g(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理可能的結(jié)果分析及應(yīng)用用用TRIzol試劑盒提取試劑盒提取RNATRIzol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫

16、氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募夹g(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理可能的結(jié)果分析及應(yīng)用醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募夹g(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理可能的結(jié)果分析及應(yīng)用醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募夹g(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理可能的結(jié)果分析及應(yīng)用醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募夹g(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理可能的結(jié)果分析及應(yīng)用引物、探針的設(shè)計(jì)和合成引物、探針的設(shè)計(jì)和合成應(yīng)用生物信息學(xué)知識(shí),從基因庫(kù)中查閱出AFP的DNA和mRNA序列。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則,并利用PrimerExpress2.0設(shè)計(jì)軟件,設(shè)計(jì)出擴(kuò)增AFPmRNA基因片段的上下游引物和探針。PCR實(shí)驗(yàn)成功的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是引物的設(shè)計(jì)。甲胎蛋白甲胎蛋白DN

17、A序列序列醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募夹g(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理可能的結(jié)果分析及應(yīng)用引物、探針的設(shè)計(jì)和合成引物、探針的設(shè)計(jì)和合成上游引物序列:5-TGGGACCCGAACTTTCCAAG-3下游引物序列:5-CCTGCAGACAATCCAGCACAT-3探針序列：5-TGTCCCTCTTCAGCAAAGCAGACT-3醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募夹g(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理可能的結(jié)果分析及應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增擴(kuò)增AFP mRNA用上述提取的的總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR。反應(yīng)體系:主要包含上下游引物、各種酶、底物、模板和Mg2+5種物質(zhì)?，F(xiàn)在以TaKaRaOneStepSYBRQRT-PCR試劑盒為例作為整個(gè)反應(yīng)體系

18、。反應(yīng)條件:針對(duì)不同的引物，設(shè)定最佳的退火溫度是QRT-PCR反應(yīng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵。具體反應(yīng)程序包括反轉(zhuǎn)錄、預(yù)變性、變形、退火、延伸等。所有過程的反應(yīng)溫度和作用時(shí)間均應(yīng)經(jīng)過篩選確定最佳反應(yīng)條件。具體反應(yīng)條件的參考值見表1，可在參考值范圍內(nèi)加減選擇最佳條件。根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度,擴(kuò)增產(chǎn)物用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,在紫外燈下割取特異性的條帶,用QIAquickGelExtractionKit(德國(guó)Qiagen公司)試劑盒（用于純化DNA）進(jìn)行純化。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募夹g(shù)路線實(shí)驗(yàn)方法及原理可能的結(jié)果分析及應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用RNaseFreedH2O（用于溶解難溶于水的RNA）將總RNA稀釋到0.2g/l，作為濃度最高的模板（20,1號(hào)）。然后取11個(gè)容量為150l的離心管（212號(hào)），分別加入10lRNaseFreedH2O。從1號(hào)管中取10l加到2號(hào)管中，稀釋倍數(shù)為1。以此類推，如圖所示，將1號(hào)主機(jī)2倍稀釋成