蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)及防褐化研究

1、    蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)及防褐化研究    陳永勝等摘要：通過改變花藥接種前的預(yù)處理、培養(yǎng)條件，建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系，結(jié)果表明：以通蓖5號為試材，4 預(yù)處理3 d，維生素c浸泡1.5 h，培養(yǎng)基中添加活性炭0.6 g/l、維生素c 200 mg/l，暗培養(yǎng)15 d可獲得高誘導(dǎo)率、低褐化率的蓖麻花藥愈傷組織。關(guān)鍵詞：蓖麻；花藥；誘導(dǎo)愈傷；防褐化： s565.604.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： a ：1002-1302（2014）03-0039-02蓖麻（ricinus communis l.）為多年或一年生雙子葉植物，多用于航空航天、化工、醫(yī)藥等行業(yè)，

2、應(yīng)用價值高、市場潛力大1。我國是蓖麻種植大國，但蓖麻新品種的開發(fā)一直局限于雜交、選擇等傳統(tǒng)育種方式，沒有將現(xiàn)代育種技術(shù)應(yīng)用于蓖麻育種2。花藥培養(yǎng)可獲得蓖麻育種上廣泛應(yīng)用的純系品種，但較低的蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)率、高褐化率一直是限制蓖麻花藥離體培養(yǎng)的主要限制性因素。外植體培養(yǎng)過程中褐化的原因很多，機(jī)理較為復(fù)雜，多認(rèn)為是培養(yǎng)條件、細(xì)胞死亡或是細(xì)胞中的酚類物質(zhì)變質(zhì)等因素導(dǎo)致3。本研究通過接種不同基因型、維生素c浸泡、改變培養(yǎng)條件（暗培養(yǎng)、添加防褐物），探索適宜蓖麻花藥培養(yǎng)的最適條件，以期有效提高誘導(dǎo)率、降低褐化率，建立高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。1 材料與方法1.1 試驗材料哲蓖4號、通蓖5號、通蓖9號蓖

3、麻花藥，采自內(nèi)蒙古民族大學(xué)試驗農(nóng)場。在溫度較低、日照較弱時，取健壯無病的植株上花被尚未張開且呈淡黃色的花蕾。1.2 試驗方法1.2.1 材料準(zhǔn)備 本研究根據(jù)黃鳳蘭等研究4，取同時期、質(zhì)優(yōu)的花蕾，流水沖洗30 min，75%乙醇消毒30 s、0.1%hgcl2滅菌2 min，無菌水沖洗35次，轉(zhuǎn)移至鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿。去除花絲，每瓶接種1/3個花蕾（約230個），封口后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。在以下的試驗設(shè)計中，每個處理接種5瓶，3次重復(fù)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基：ms+蔗糖40 g/l+瓊脂7 g/l+脯氨酸600 mg/l+酸性水解酪蛋白600 mg/l+naa 1.0 mg/l+zt 3.0 mg/l，ph值

4、=6.0。1.2.2 蓖麻花藥誘導(dǎo)愈傷防褐化體系篩選1.2.2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率 取哲蓖4號、通蓖5號、通蓖9號花藥，在相同培養(yǎng)條件下篩選最佳花藥愈傷誘導(dǎo)基因型，并統(tǒng)計花藥低溫預(yù)處理1、3、5、7、9 d時的誘導(dǎo)率及褐化率。1.2.2.2 暗處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號花藥為材料，接種后暗處理0、5、10、15、20 d，統(tǒng)計花藥愈傷誘導(dǎo)率及褐化率。1.2.2.3 維生素c浸泡處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號花藥為材料，置于100 mg/l 維生素c中分別浸泡0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h，統(tǒng)計蓖麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率與褐化率。1.2.2

5、.4 防褐附加物對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號花藥為材料，分別接種于添加不同濃度活性炭 （0、0.3、0.6、0.9、1.2 g/l）和維生素c （0、100、150、200、250 mg/l）的培養(yǎng)基中，統(tǒng)計誘導(dǎo)率及褐化率。2 結(jié)果與分析2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率從表1可知，3個基因型的愈傷誘導(dǎo)率均隨著低溫預(yù)處理時間的增加呈先增后減的趨勢，褐化率均呈先減后增的趨勢，且均在低溫處理3d時褐化率最低。褐化具有一定的傳播性，故選擇褐化率最低、誘導(dǎo)率最高的最適基因型。綜合表1可知，愈傷組織的褐化率與基因型差異相關(guān)，通蓖5號在低溫預(yù)處理3 d時褐化率最低（3.20%），且此時3

6、個基因型中通蓖5號愈傷誘導(dǎo)率也最高（15.94%）。2.2 暗處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響如表2所示，花藥愈傷誘導(dǎo)率隨暗處理時間的增加有所提高，愈傷褐化率隨時間的增加先減后增，且在暗處理15 d時愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最大值、褐化率達(dá)到最小值。2.3 維生素c浸泡處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響如表3所示，維生素c浸泡處理顯著提高了花藥愈傷誘導(dǎo)率，褐化率隨著時間的增加呈先減后增的趨勢。浸泡1.5 h時誘導(dǎo)率最高（28.56%）、褐化率最低（7.42%）。2.4 防褐附加物對愈傷組織誘導(dǎo)的影響由表4可知，隨著活性炭量的增加，誘導(dǎo)率呈先升后降的趨勢，褐化率呈先降后升的趨勢，且濃度為0.6 g/l時誘導(dǎo)率最高（32.8

7、3%）、褐化率最低（11.28%）。培養(yǎng)基中添加維生素c后，誘導(dǎo)率及褐化率與添加活性炭的變化幾乎一致，且濃度為200 mg/l時獲得最大花藥愈傷誘導(dǎo)率（27.32%）、最小褐化率（8.21%）。蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)過程見圖1。3 討論組織培養(yǎng)過程中，外植體可能由于內(nèi)分泌紊亂等原因分泌出酚等不利于組織生長、乃至影響存活的有害成分，導(dǎo)致組織褐化或死亡。故需在不影響愈傷誘導(dǎo)率的前提下，通過改變培養(yǎng)環(huán)境等因素建立高質(zhì)量愈傷誘導(dǎo)體系。組織離體培養(yǎng)過程中不同基因型愈傷誘導(dǎo)的能力存在差異，有些組織較難形成愈傷5。本研究分析了通蓖5號、哲蓖4號、通蓖9號的愈傷誘導(dǎo)差異，結(jié)果與邵志敏等所分析的結(jié)果6一致，通蓖5號的

8、誘導(dǎo)率及防褐能力均要高于其他2個品種，且4 遇冷可以有效地降低蓖麻花藥愈傷的褐化率。本研究又通過篩選不同的暗處理和維生素c浸泡時間、添加不同濃度的防褐物（活性炭、維生素c），有效地提高了誘導(dǎo)率、降低了褐化率，成功地建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。這與很多研究成果均不謀而合。雷攀登等發(fā)現(xiàn)10 下避光離體培養(yǎng)茶樹腋芽48 h時褐變率最低7。張文娥等使用維生素c 5 g/l浸泡碧桃莖段30 min能有效抑制碧桃褐化8，這與本研究采用維生素c浸泡的效果相近。呂宗友等發(fā)現(xiàn)適當(dāng)添加活性炭、維生素c均能不同程度地提高愈傷誘導(dǎo)率和降低褐化率9。韋鳳娟等發(fā)現(xiàn)添加維生素c、pvp、活性炭可有效控制外植體褐化現(xiàn)象1

9、0。鄭穎等發(fā)現(xiàn)添加活性炭3 g/l可以將臺灣榿木組織培養(yǎng)的褐化率控制在36.7%45.6%11。蓖麻花藥離體培養(yǎng)的影響因素很多，與其他植物花藥或是其余部位的誘導(dǎo)率相比還較低，還需要進(jìn)一步完善，以建立高效蓖麻花藥再生體系，為培育高產(chǎn)高效的蓖麻良種奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：1鄭 鷺，祁建民，陳紹軍，等. 蓖麻遺傳育種進(jìn)展及其在生物能源與醫(yī)藥綜合利用潛勢j. 中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（9）：109-113.2曾祥艷，王東雪，馬錦林. 我國蓖麻良種選育研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略j. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2010，131（6）：27-29.3楊亞萍，鄭新強(qiáng). 茶樹組織培養(yǎng)中的褐化控制研究j. 茶葉，2013，39（1）

10、：3-7.4黃鳳蘭，薩日娜，孟凡娟，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的研究j. 作物雜志，2009（6）：59-63.5宋欽虎，郭新梅，裴玉賀，等. 抑制玉米幼胚愈傷組織褐化的研究j. 農(nóng)學(xué)學(xué)報，2012，2（5）：24-28.6邵志敏，陳永勝，黃鳳蘭，等. 低溫預(yù)處理與光照條件對蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響j. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，27（2）：189-193.7雷攀登，吳 瓊，徐奕鼎，等. 茶樹腋芽離體培養(yǎng)中的褐化控制研究j. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（7）：190-193.8張文娥，潘學(xué)軍，楊仕國，等. 碧桃組織培養(yǎng)中褐化及其抑制研究j. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1

11、）：11-12.9呂宗友，蘇衍菁，趙國琦，等. 不同防褐化措施對蘇丹草愈傷誘導(dǎo)以及抗褐化的效果研究j. 草業(yè)學(xué)報，2011，20（3）：174-181.10韋鳳娟，廖克波，楊 梅，等. 擎天樹組培外植體消毒與褐化抑制的研究j. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（31）：18-22.11鄭 穎，秦紅玫，黎云祥. 臺灣榿木組織培養(yǎng)中污染和褐化的防止j. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：64-65，117. 摘要：通過改變花藥接種前的預(yù)處理、培養(yǎng)條件，建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系，結(jié)果表明：以通蓖5號為試材，4 預(yù)處理3 d，維生素c浸泡1.5 h，培養(yǎng)基中添加活性炭0.6 g/l、維生素c 20

12、0 mg/l，暗培養(yǎng)15 d可獲得高誘導(dǎo)率、低褐化率的蓖麻花藥愈傷組織。關(guān)鍵詞：蓖麻；花藥；誘導(dǎo)愈傷；防褐化： s565.604.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： a ：1002-1302（2014）03-0039-02蓖麻（ricinus communis l.）為多年或一年生雙子葉植物，多用于航空航天、化工、醫(yī)藥等行業(yè)，應(yīng)用價值高、市場潛力大1。我國是蓖麻種植大國，但蓖麻新品種的開發(fā)一直局限于雜交、選擇等傳統(tǒng)育種方式，沒有將現(xiàn)代育種技術(shù)應(yīng)用于蓖麻育種2?；ㄋ幣囵B(yǎng)可獲得蓖麻育種上廣泛應(yīng)用的純系品種，但較低的蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)率、高褐化率一直是限制蓖麻花藥離體培養(yǎng)的主要限制性因素。外植體培養(yǎng)過程中褐化的原因很多

13、，機(jī)理較為復(fù)雜，多認(rèn)為是培養(yǎng)條件、細(xì)胞死亡或是細(xì)胞中的酚類物質(zhì)變質(zhì)等因素導(dǎo)致3。本研究通過接種不同基因型、維生素c浸泡、改變培養(yǎng)條件（暗培養(yǎng)、添加防褐物），探索適宜蓖麻花藥培養(yǎng)的最適條件，以期有效提高誘導(dǎo)率、降低褐化率，建立高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。1 材料與方法1.1 試驗材料哲蓖4號、通蓖5號、通蓖9號蓖麻花藥，采自內(nèi)蒙古民族大學(xué)試驗農(nóng)場。在溫度較低、日照較弱時，取健壯無病的植株上花被尚未張開且呈淡黃色的花蕾。1.2 試驗方法1.2.1 材料準(zhǔn)備 本研究根據(jù)黃鳳蘭等研究4，取同時期、質(zhì)優(yōu)的花蕾，流水沖洗30 min，75%乙醇消毒30 s、0.1%hgcl2滅菌2 min，無菌水沖洗35次

14、，轉(zhuǎn)移至鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿。去除花絲，每瓶接種1/3個花蕾（約230個），封口后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。在以下的試驗設(shè)計中，每個處理接種5瓶，3次重復(fù)?；A(chǔ)培養(yǎng)基：ms+蔗糖40 g/l+瓊脂7 g/l+脯氨酸600 mg/l+酸性水解酪蛋白600 mg/l+naa 1.0 mg/l+zt 3.0 mg/l，ph值=6.0。1.2.2 蓖麻花藥誘導(dǎo)愈傷防褐化體系篩選1.2.2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率 取哲蓖4號、通蓖5號、通蓖9號花藥，在相同培養(yǎng)條件下篩選最佳花藥愈傷誘導(dǎo)基因型，并統(tǒng)計花藥低溫預(yù)處理1、3、5、7、9 d時的誘導(dǎo)率及褐化率。1.2.2.2 暗處理對愈傷組織誘導(dǎo)的

15、影響 以通蓖5號花藥為材料，接種后暗處理0、5、10、15、20 d，統(tǒng)計花藥愈傷誘導(dǎo)率及褐化率。1.2.2.3 維生素c浸泡處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號花藥為材料，置于100 mg/l 維生素c中分別浸泡0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h，統(tǒng)計蓖麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率與褐化率。1.2.2.4 防褐附加物對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號花藥為材料，分別接種于添加不同濃度活性炭 （0、0.3、0.6、0.9、1.2 g/l）和維生素c （0、100、150、200、250 mg/l）的培養(yǎng)基中，統(tǒng)計誘導(dǎo)率及褐化率。2 結(jié)果與分析2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率

16、從表1可知，3個基因型的愈傷誘導(dǎo)率均隨著低溫預(yù)處理時間的增加呈先增后減的趨勢，褐化率均呈先減后增的趨勢，且均在低溫處理3d時褐化率最低。褐化具有一定的傳播性，故選擇褐化率最低、誘導(dǎo)率最高的最適基因型。綜合表1可知，愈傷組織的褐化率與基因型差異相關(guān)，通蓖5號在低溫預(yù)處理3 d時褐化率最低（3.20%），且此時3個基因型中通蓖5號愈傷誘導(dǎo)率也最高（15.94%）。2.2 暗處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響如表2所示，花藥愈傷誘導(dǎo)率隨暗處理時間的增加有所提高，愈傷褐化率隨時間的增加先減后增，且在暗處理15 d時愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最大值、褐化率達(dá)到最小值。2.3 維生素c浸泡處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響如表3所示，維

17、生素c浸泡處理顯著提高了花藥愈傷誘導(dǎo)率，褐化率隨著時間的增加呈先減后增的趨勢。浸泡1.5 h時誘導(dǎo)率最高（28.56%）、褐化率最低（7.42%）。2.4 防褐附加物對愈傷組織誘導(dǎo)的影響由表4可知，隨著活性炭量的增加，誘導(dǎo)率呈先升后降的趨勢，褐化率呈先降后升的趨勢，且濃度為0.6 g/l時誘導(dǎo)率最高（32.83%）、褐化率最低（11.28%）。培養(yǎng)基中添加維生素c后，誘導(dǎo)率及褐化率與添加活性炭的變化幾乎一致，且濃度為200 mg/l時獲得最大花藥愈傷誘導(dǎo)率（27.32%）、最小褐化率（8.21%）。蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)過程見圖1。3 討論組織培養(yǎng)過程中，外植體可能由于內(nèi)分泌紊亂等原因分泌出酚等不利

18、于組織生長、乃至影響存活的有害成分，導(dǎo)致組織褐化或死亡。故需在不影響愈傷誘導(dǎo)率的前提下，通過改變培養(yǎng)環(huán)境等因素建立高質(zhì)量愈傷誘導(dǎo)體系。組織離體培養(yǎng)過程中不同基因型愈傷誘導(dǎo)的能力存在差異，有些組織較難形成愈傷5。本研究分析了通蓖5號、哲蓖4號、通蓖9號的愈傷誘導(dǎo)差異，結(jié)果與邵志敏等所分析的結(jié)果6一致，通蓖5號的誘導(dǎo)率及防褐能力均要高于其他2個品種，且4 遇冷可以有效地降低蓖麻花藥愈傷的褐化率。本研究又通過篩選不同的暗處理和維生素c浸泡時間、添加不同濃度的防褐物（活性炭、維生素c），有效地提高了誘導(dǎo)率、降低了褐化率，成功地建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。這與很多研究成果均不謀而合。雷攀登等發(fā)現(xiàn)10

19、 下避光離體培養(yǎng)茶樹腋芽48 h時褐變率最低7。張文娥等使用維生素c 5 g/l浸泡碧桃莖段30 min能有效抑制碧桃褐化8，這與本研究采用維生素c浸泡的效果相近。呂宗友等發(fā)現(xiàn)適當(dāng)添加活性炭、維生素c均能不同程度地提高愈傷誘導(dǎo)率和降低褐化率9。韋鳳娟等發(fā)現(xiàn)添加維生素c、pvp、活性炭可有效控制外植體褐化現(xiàn)象10。鄭穎等發(fā)現(xiàn)添加活性炭3 g/l可以將臺灣榿木組織培養(yǎng)的褐化率控制在36.7%45.6%11。蓖麻花藥離體培養(yǎng)的影響因素很多，與其他植物花藥或是其余部位的誘導(dǎo)率相比還較低，還需要進(jìn)一步完善，以建立高效蓖麻花藥再生體系，為培育高產(chǎn)高效的蓖麻良種奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：1鄭 鷺，祁建民，陳紹軍，

20、等. 蓖麻遺傳育種進(jìn)展及其在生物能源與醫(yī)藥綜合利用潛勢j. 中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（9）：109-113.2曾祥艷，王東雪，馬錦林. 我國蓖麻良種選育研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略j. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2010，131（6）：27-29.3楊亞萍，鄭新強(qiáng). 茶樹組織培養(yǎng)中的褐化控制研究j. 茶葉，2013，39（1）：3-7.4黃鳳蘭，薩日娜，孟凡娟，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的研究j. 作物雜志，2009（6）：59-63.5宋欽虎，郭新梅，裴玉賀，等. 抑制玉米幼胚愈傷組織褐化的研究j. 農(nóng)學(xué)學(xué)報，2012，2（5）：24-28.6邵志敏，陳永勝，黃鳳蘭，等. 低溫預(yù)處理與光照條件對蓖麻花藥愈傷組

21、織誘導(dǎo)的影響j. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，27（2）：189-193.7雷攀登，吳 瓊，徐奕鼎，等. 茶樹腋芽離體培養(yǎng)中的褐化控制研究j. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（7）：190-193.8張文娥，潘學(xué)軍，楊仕國，等. 碧桃組織培養(yǎng)中褐化及其抑制研究j. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：11-12.9呂宗友，蘇衍菁，趙國琦，等. 不同防褐化措施對蘇丹草愈傷誘導(dǎo)以及抗褐化的效果研究j. 草業(yè)學(xué)報，2011，20（3）：174-181.10韋鳳娟，廖克波，楊 梅，等. 擎天樹組培外植體消毒與褐化抑制的研究j. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（31）：18-22.11鄭 穎，

22、秦紅玫，黎云祥. 臺灣榿木組織培養(yǎng)中污染和褐化的防止j. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：64-65，117. 摘要：通過改變花藥接種前的預(yù)處理、培養(yǎng)條件，建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系，結(jié)果表明：以通蓖5號為試材，4 預(yù)處理3 d，維生素c浸泡1.5 h，培養(yǎng)基中添加活性炭0.6 g/l、維生素c 200 mg/l，暗培養(yǎng)15 d可獲得高誘導(dǎo)率、低褐化率的蓖麻花藥愈傷組織。關(guān)鍵詞：蓖麻；花藥；誘導(dǎo)愈傷；防褐化： s565.604.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： a ：1002-1302（2014）03-0039-02蓖麻（ricinus communis l.）為多年或一年生雙子葉植物，多用于航空航天

23、、化工、醫(yī)藥等行業(yè)，應(yīng)用價值高、市場潛力大1。我國是蓖麻種植大國，但蓖麻新品種的開發(fā)一直局限于雜交、選擇等傳統(tǒng)育種方式，沒有將現(xiàn)代育種技術(shù)應(yīng)用于蓖麻育種2?；ㄋ幣囵B(yǎng)可獲得蓖麻育種上廣泛應(yīng)用的純系品種，但較低的蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)率、高褐化率一直是限制蓖麻花藥離體培養(yǎng)的主要限制性因素。外植體培養(yǎng)過程中褐化的原因很多，機(jī)理較為復(fù)雜，多認(rèn)為是培養(yǎng)條件、細(xì)胞死亡或是細(xì)胞中的酚類物質(zhì)變質(zhì)等因素導(dǎo)致3。本研究通過接種不同基因型、維生素c浸泡、改變培養(yǎng)條件（暗培養(yǎng)、添加防褐物），探索適宜蓖麻花藥培養(yǎng)的最適條件，以期有效提高誘導(dǎo)率、降低褐化率，建立高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。1 材料與方法1.1 試驗材料哲蓖4號、

24、通蓖5號、通蓖9號蓖麻花藥，采自內(nèi)蒙古民族大學(xué)試驗農(nóng)場。在溫度較低、日照較弱時，取健壯無病的植株上花被尚未張開且呈淡黃色的花蕾。1.2 試驗方法1.2.1 材料準(zhǔn)備 本研究根據(jù)黃鳳蘭等研究4，取同時期、質(zhì)優(yōu)的花蕾，流水沖洗30 min，75%乙醇消毒30 s、0.1%hgcl2滅菌2 min，無菌水沖洗35次，轉(zhuǎn)移至鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿。去除花絲，每瓶接種1/3個花蕾（約230個），封口后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。在以下的試驗設(shè)計中，每個處理接種5瓶，3次重復(fù)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基：ms+蔗糖40 g/l+瓊脂7 g/l+脯氨酸600 mg/l+酸性水解酪蛋白600 mg/l+naa 1.0 mg/l+zt 3.

25、0 mg/l，ph值=6.0。1.2.2 蓖麻花藥誘導(dǎo)愈傷防褐化體系篩選1.2.2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率 取哲蓖4號、通蓖5號、通蓖9號花藥，在相同培養(yǎng)條件下篩選最佳花藥愈傷誘導(dǎo)基因型，并統(tǒng)計花藥低溫預(yù)處理1、3、5、7、9 d時的誘導(dǎo)率及褐化率。1.2.2.2 暗處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號花藥為材料，接種后暗處理0、5、10、15、20 d，統(tǒng)計花藥愈傷誘導(dǎo)率及褐化率。1.2.2.3 維生素c浸泡處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號花藥為材料，置于100 mg/l 維生素c中分別浸泡0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h，統(tǒng)計蓖麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率

26、與褐化率。1.2.2.4 防褐附加物對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以通蓖5號花藥為材料，分別接種于添加不同濃度活性炭 （0、0.3、0.6、0.9、1.2 g/l）和維生素c （0、100、150、200、250 mg/l）的培養(yǎng)基中，統(tǒng)計誘導(dǎo)率及褐化率。2 結(jié)果與分析2.1 不同基因型及低溫預(yù)處理愈傷誘導(dǎo)率和褐化率從表1可知，3個基因型的愈傷誘導(dǎo)率均隨著低溫預(yù)處理時間的增加呈先增后減的趨勢，褐化率均呈先減后增的趨勢，且均在低溫處理3d時褐化率最低。褐化具有一定的傳播性，故選擇褐化率最低、誘導(dǎo)率最高的最適基因型。綜合表1可知，愈傷組織的褐化率與基因型差異相關(guān)，通蓖5號在低溫預(yù)處理3 d時褐化率最低（3

27、.20%），且此時3個基因型中通蓖5號愈傷誘導(dǎo)率也最高（15.94%）。2.2 暗處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響如表2所示，花藥愈傷誘導(dǎo)率隨暗處理時間的增加有所提高，愈傷褐化率隨時間的增加先減后增，且在暗處理15 d時愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最大值、褐化率達(dá)到最小值。2.3 維生素c浸泡處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響如表3所示，維生素c浸泡處理顯著提高了花藥愈傷誘導(dǎo)率，褐化率隨著時間的增加呈先減后增的趨勢。浸泡1.5 h時誘導(dǎo)率最高（28.56%）、褐化率最低（7.42%）。2.4 防褐附加物對愈傷組織誘導(dǎo)的影響由表4可知，隨著活性炭量的增加，誘導(dǎo)率呈先升后降的趨勢，褐化率呈先降后升的趨勢，且濃度為0.6 g/l時

28、誘導(dǎo)率最高（32.83%）、褐化率最低（11.28%）。培養(yǎng)基中添加維生素c后，誘導(dǎo)率及褐化率與添加活性炭的變化幾乎一致，且濃度為200 mg/l時獲得最大花藥愈傷誘導(dǎo)率（27.32%）、最小褐化率（8.21%）。蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)過程見圖1。3 討論組織培養(yǎng)過程中，外植體可能由于內(nèi)分泌紊亂等原因分泌出酚等不利于組織生長、乃至影響存活的有害成分，導(dǎo)致組織褐化或死亡。故需在不影響愈傷誘導(dǎo)率的前提下，通過改變培養(yǎng)環(huán)境等因素建立高質(zhì)量愈傷誘導(dǎo)體系。組織離體培養(yǎng)過程中不同基因型愈傷誘導(dǎo)的能力存在差異，有些組織較難形成愈傷5。本研究分析了通蓖5號、哲蓖4號、通蓖9號的愈傷誘導(dǎo)差異，結(jié)果與邵志敏等所分析的結(jié)果6一致，通蓖5號的誘導(dǎo)率及防褐能力均要高于其他2個品種，且4 遇冷可以有效地降低蓖麻花藥愈傷的褐化率。本研究又通過篩選不同的暗處理和維生素c浸泡時間、添加不同濃度的防褐物（活性炭、維生素c），有效地提高了誘導(dǎo)率、降低了褐化率，成功地建立了高效蓖麻花藥愈傷誘導(dǎo)體系。這與很多研究成果均不謀而合。雷攀登等發(fā)現(xiàn)10 下避光離體培養(yǎng)茶樹腋芽48 h時褐