龍葵對鎘污染土壤的響應(yīng)及其修復(fù)效應(yīng)研究

1、    龍葵對鎘污染土壤的響應(yīng)及其修復(fù)效應(yīng)研究    孫正國摘要：以礦區(qū)不同范圍內(nèi)（對照組、市內(nèi)、礦區(qū)周邊農(nóng)田、礦區(qū)邊緣、礦區(qū)和尾礦）土壤為培養(yǎng)基質(zhì)盆栽重金屬超富集植物龍葵（solanum nigrum），研究其對鎘污染土壤修復(fù)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同樣地土壤含鎘量不同，土壤中鎘含量（cd >20 mg/kg）遞增對龍葵生長和光合作用產(chǎn)生明顯負(fù)面影響，如生物量遞減、光合效率降低。其次，龍葵在鎘污染土壤的脅迫下，超氧化物歧化酶（sod）、過氧化物酶（pod）、丙二醛（mda）含量增加。此外，土壤中鎘含量的增加龍葵中與鎘轉(zhuǎn)運有關(guān)的基因表達水平也顯著增加。以

2、上結(jié)果表明，過量的鎘對龍葵的生長發(fā)育有負(fù)面影響，促進植物體有害物質(zhì)（過氧化物和mda）的積累，同時龍葵自身也通過合成相關(guān)的酶清除體內(nèi)有害物質(zhì)，減輕損害，如通過快速合成相關(guān)鎘轉(zhuǎn)運蛋白，增強龍葵對土壤中鎘的吸收和積累，從而減少土壤中鎘的含量。關(guān)鍵詞：龍葵；鎘污染；有害物質(zhì)積累；基因表達；real-time pcr；光合作用；抗氧化酶： x53 文獻標(biāo)志碼： a ：1002-1302（2015）10-0397-05近十幾年來，我國金屬礦山開采高速發(fā)展，礦山周邊土壤受到重金屬污染日益嚴(yán)重1-2。造成土壤污染的重金屬主要包括as、cd、hg、pb、cu、zn、co、mn、ni、cr等，其中鎘污染是最常見

3、的重金屬污染之一，在土壤中具有較強的化學(xué)活性，與其他重金屬相比，更易被植物吸收，具有很強的從土壤向植物遷移的能力3-6。土壤中鎘含量過多將會使植物受到嚴(yán)重毒害，植物表現(xiàn)為生長緩慢、植株矮小、褪綠等中毒癥狀，其細(xì)胞的膜透性、光合代謝、呼吸代謝、酶代謝、遺傳效應(yīng)等也發(fā)生改變，生物量下降7-9。如何消除土壤環(huán)境中的重金屬污染物已經(jīng)成為國際性難題。因此，20世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來的利用植物修復(fù)（phytoremediation）技術(shù)修復(fù)鎘污染土壤的研究逐漸成為研究熱門，相對于傳統(tǒng)的重金屬污染土壤治理方法，如換土法、淋洗法、化學(xué)氧化法等，植物修復(fù)技術(shù)具有經(jīng)濟、環(huán)保綠色的優(yōu)勢，因而具有極大的潛力10-1

4、2。重金屬污染土壤的植物修復(fù)主要是指利用超富集植物（hyperaccu-mulator）的提取作用將土壤中超量的重金屬去除，從而達到清潔污染土壤的目的13。目前，香根草、續(xù)斷菊、蜈蚣草、鱗苔草、印度芥菜、龍葵等都是重金屬超富集型植物。龍葵作為新型重金屬超富集植物對鎘具有較強的耐受性，主要通過螯合作用，限制鎘的吸收和在植物體內(nèi)的運輸，區(qū)域化以及相應(yīng)酶的解毒作用，也通過形成對鎘高度親和的高分子量絡(luò)合物或是調(diào)節(jié)相關(guān)重金屬轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)對鎘的聚集和解毒。本試驗以新型鎘超富集植物龍葵為材料，研究了不同濃度鎘污染土壤對龍葵植株生理生長、抗氧化系統(tǒng)、光合作用等生理特性和鎘吸收積累特性的影響，探討了鎘脅迫下超

5、富集植物龍葵的生理響應(yīng)機制以及龍葵對鎘污染土壤的修復(fù)基質(zhì)。1 材料與方法1.1 樣地概況銅山口礦區(qū)地處長江中下游銅鐵成礦帶西端，位于湖北省大冶市境內(nèi)，屬于我國典型的露天開采的中型銅礦，該礦床為矽卡巖斑巖復(fù)合型礦床。礦區(qū)坐標(biāo)是141°50217e、30°035n。該礦床主要出產(chǎn)有色金屬礦cu，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)夾含少量各類重金屬，如as、cd、hg、pb、zn、co、mn、ni、cr等。1.2 試驗設(shè)計與方法1.2.1 采集樣地及樣品理化性質(zhì)測定 2013年6月分別采集尾礦、礦區(qū)、礦區(qū)邊緣、礦區(qū)周邊農(nóng)田、大冶市內(nèi)以及對照土壤，樣品袋保存，于實驗室分揀粗砂、枯枝爛葉等雜質(zhì)，自然風(fēng)干。p

6、h值采用電極電位法測定（1 2.5土水比）；土壤全氮（g/kg）用凱氏定氮法測定；土壤全磷（g/kg）用 naoh 熔融-鉬銻抗比色法測定；根莖葉果實中鎘含量用hno3-h2o2微波消解（cem mars-5）-原子吸收法（tas-990普析通用原子吸收分光光度計）測定，用植物樣本（gbw08510）進行質(zhì)量分析；土壤中鎘含量用鹽酸-硝酸-氫氟酸-高氯酸消解-原子吸收法測定，用土壤標(biāo)樣（gbw08303）進行質(zhì)量分析14-16。1.2.2 龍葵光合及生理生長指標(biāo)測定 2013年8月，用直尺測量并記錄龍葵株高；分別收獲龍葵根、莖、葉和果實，測量鮮質(zhì)量，并于120 烘箱殺青2 h，再調(diào)至80 烘烤

7、48 h，分別稱量干質(zhì)量。在龍葵培養(yǎng)期間，每隔1個月，用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xpam-2500（walz，德國） 進行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。每個處理重復(fù)選取至少3張活體全葉葉片進行暗適應(yīng)30 min，檢測時先用測量光（0.5 mol/m2·s） 測定初始熒光fo，飽和光脈沖2 700 mol/（m2·s）（脈沖時間0.8 s）誘導(dǎo)fm，光化光強度為186 mol/（m2·s），主要測量能夠反映光合系統(tǒng)（ps）活性的初始熒光強度（fo）、最大原初始光能轉(zhuǎn)換效率（fv/fm）、最大電子傳遞速率（etr），以及反映植物熱耗散能力的ps非光化學(xué)淬滅系數(shù)（qn）。1.2.3

8、 龍葵抗氧化系統(tǒng)酶活測定 參照李合生的方法17測定丙二醛（mda）含量。超氧化物歧化酶（sod）活性的測定采用nbt光還原法，利用sod對氮藍四唑（nbt）的光抑制作用，在560 nm處測定吸光度18。計算公式如下：sod活性（u/g）=樣品液體積×（對照管d-樣品管d）/對照管d加入酶液的量×50%樣品鮮質(zhì)量。1.2.4 鎘轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達變化 rna提?。悍謩e剪取新鮮的龍葵葉片，參考q-biogene 公司的rna提取試劑盒（fastrna pro green kit） 提取rna。cdna合成：參考invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（superscript ）合成

9、cdna。real time-pcr：參考applied biosystems 公司的power sybr green pcr master mix（10 l） 說明，構(gòu)建反應(yīng)體系。pcr引物如表1。endprint通過 real-time pcr 試驗，得出所有基因的ct值。以 gapdh 和 tubulin 基因為內(nèi)參基因，計算出ct。在市內(nèi)、礦區(qū)周邊農(nóng)田、礦區(qū)邊緣、礦區(qū)及尾礦龍葵基因表達的分析中，以 mt2a基因的表達為定標(biāo)。在對照組龍葵基因表達的分析中，以pcs基因為定標(biāo)。計算出ct并作記錄，通過下列公式計算rq：rq=2-ct。1.3 數(shù)據(jù)分析采用spss 16.0數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)

10、據(jù)處理，運用最小顯著差數(shù)法（lsd）進行顯著性分析。用originpro 7.5軟件作圖。2 結(jié)果與分析2.1 樣地土壤理化性質(zhì)礦區(qū)不同區(qū)域內(nèi)土壤ph值差異顯著，總體上呈現(xiàn)越靠近礦區(qū)土壤ph值越小，酸度越大的趨勢（表2）。農(nóng)田中因農(nóng)作物生長需要，認(rèn)為施肥較多，土壤中氮磷含量較其他地區(qū)差異顯著，對照組和市內(nèi)土壤之間，礦區(qū)外緣、礦區(qū)以及尾礦土壤之間氮磷含量差異都不顯著。不同區(qū)域土壤中重金屬鎘含量差異極顯著，其中礦區(qū)周邊農(nóng)田、礦區(qū)外緣、礦區(qū)及尾礦顯著超出國家土壤鎘含量最低三級標(biāo)準(zhǔn)（1.0 mg/kg）標(biāo)準(zhǔn)值，尾礦中的礦物經(jīng)處理后的殘渣中鎘含量更是高于標(biāo)準(zhǔn)值200倍，其礦區(qū)周邊的農(nóng)田土壤中鎘含量也超標(biāo)

11、，受到污染。2.2 龍葵生理生長及光合特性隨著供試土壤中鎘含量的增加，龍葵受到脅迫程度也在增加，主要表現(xiàn)為生長緩慢、高度變低、各部分生物量減小，尤其是礦區(qū)和尾礦土壤所栽培的龍葵株高及生物量較其他區(qū)域土壤栽培龍葵差異明顯 （表3）。同時，鎘含量的增加引起ps反應(yīng)系統(tǒng)中初始熒光水平（fo）的增加，而最大原初光能轉(zhuǎn)化效率（fv/fm）、最大電子傳遞速率（etr）明顯降低（圖1），說明ps反應(yīng)系統(tǒng)遭受破壞或可逆失活。此外，植物捕光色素吸收光能后以熱的形式耗散過剩激發(fā)能的能力（qn）也明顯上升，說明它們啟動熱耗散來消耗過量的激發(fā)能，以減輕重金屬鎘脅迫對其光合系統(tǒng)的損傷。2.3 龍葵對鎘的富集特性經(jīng)過8個

12、月的生長，測定培養(yǎng)基質(zhì)土壤理化性質(zhì)，各區(qū)域土壤較采樣前土壤ph值，總氮磷含量變化不明顯，生長過程中噴施霍格蘭式營養(yǎng)液，氮磷含量略有變化，而各區(qū)域土壤中鎘含量有明顯減少，說明這段時間內(nèi)土壤中鎘有轉(zhuǎn)移（表4）。再對龍葵各部分鎘含量進行測定，龍葵中鎘含量明顯增加，說明其吸收了土壤中的鎘并富集在植物的不同組織，根吸收水分和營養(yǎng)元素，同時也能吸附土壤當(dāng)中的鎘，再通過向上運輸富集在營養(yǎng)器官果實中，因此根和果實中富集鎘最多，葉莖次之，而且檢測發(fā)現(xiàn)龍葵對鎘的吸收多少可能和所生長土壤當(dāng)中的鎘含量有顯著相關(guān)，當(dāng)土壤中鎘含量較高時，龍葵容易吸收富集更多的鎘（圖2）。2.4 龍葵sod和mda的積累土壤中的鎘含量達到

13、一定的濃度時會對植物生長產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生過量的活性氧（reactive oxygen species，ros）19-22，例如超氧化物 o-2 · 和過氧化氫（h2o2）等，同時植物會啟動自身防御，產(chǎn)生多種抗氧化酶（如sod），清除過氧化物23-26；還可能引起細(xì)胞過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生過多的mda，毒害植物細(xì)胞27。在不同鎘含量土壤中生長的龍葵mda含量不同，呈現(xiàn)土壤中鎘含量越高，龍葵吸收鎘越多，產(chǎn)生的mda越多，對植物毒害越大（圖3）。在對不同土壤中生長龍葵細(xì)胞內(nèi)sod活性測定發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞中sod積累與鎘含量大小有關(guān)，鎘含量大，植物體內(nèi)過氧化物積累增多，相應(yīng)sod活性增強，

14、緩解過氧化物積累對植物細(xì)胞產(chǎn)生的損害（圖4）。2.5 與鎘吸收轉(zhuǎn)運有關(guān)基因的表達p型atp酶（p type-atpase）中hma亞族能夠轉(zhuǎn)運多種必需金屬以保證植物從土壤中吸取足夠的養(yǎng)分，然而這些金屬轉(zhuǎn)運體在轉(zhuǎn)運必需元素的同時，也大多可以參與鎘等有毒重金屬離子吸收轉(zhuǎn)運28-30；hvmt基因家族中hvmt-1，hvmt-3，hvmt-4等參與植物金屬硫蛋白的表達，而金屬硫蛋白能與有毒重金屬離子結(jié)合31。real-time pcr實時監(jiān)測龍葵中與鎘吸收轉(zhuǎn)運有關(guān)基因（p type-atpase，hvmt-1，hvmt-3，hvmt-4）的表達。不同鎘含量土壤中龍葵的四種鎘轉(zhuǎn)運基因表達具有相似性，鎘

15、含量越高、基因表達增強，對鎘的吸收也增多，尾礦>礦區(qū)>礦區(qū)邊緣>礦區(qū)周邊農(nóng)田>市內(nèi)>對照組（圖5）。3 討論過量的非必需重金屬鎘嚴(yán)重抑制植物生長，對植物產(chǎn)生毒害作用32-33，通常鎘會降低植物對水分脅迫的耐性，在相對水分含量和葉片水勢較高時使膨壓喪失，影響植物對水分吸收并引起根部的損傷34。鎘是光合作用的一種有效抑制劑，鎘進入植物體內(nèi)，影響光合色素的合成，降低葉綠素含量，影響并破壞光合系統(tǒng)35。此外，植物吸收過量的鎘會誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過氧化氫類物質(zhì)，對植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致酶活性喪失，生物膜破壞或生物氧化脅迫36-37。同樣的植物也會產(chǎn)生相應(yīng)的緩解機制，例如產(chǎn)生超氧化

16、物歧化酶等消除植物細(xì)胞中過多的過氧化物，上調(diào)或下調(diào)相關(guān)基因表達或是合成與重金屬結(jié)合的金屬硫蛋白和螯合蛋白等38。在本試驗中，土壤鎘含量越大，龍葵吸收的鎘也增多，而鎘也會對龍葵的生理生長和光合特性產(chǎn)生較顯著影響，隨著鎘龍葵體內(nèi)鎘含量積累，過量的鎘可能減弱細(xì)胞分裂增長從而影響龍葵的株高、根長和生物量等生理指標(biāo)。龍葵葉片收到鎘脅迫，ps反應(yīng)系統(tǒng)中初始熒光水平顯著增大，最大原初光能轉(zhuǎn)化效率、最大電子傳遞速率顯著降低，這說明ps反應(yīng)系統(tǒng)遭受破壞或可逆失活。同樣，植物捕光色素吸收光能后以熱的形式耗散過剩激發(fā)能的能力也顯著上升，它以這種形式來緩解鎘對植物體的損傷。試驗中龍葵體內(nèi)鎘含量的積累還導(dǎo)致植物細(xì)胞的氧

17、化脅迫，使植物體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧和 mda，損傷植物dna、膜脂蛋白等，加速細(xì)胞衰老和凋亡4，39-40。然而當(dāng)龍葵受到鎘脅迫時，立即合成各種抗氧化酶，如sod、cat、pod，這些酶能有效地將植物細(xì)胞內(nèi)的過氧化物還原成h2o，緩解過氧化物過多引起的損傷。比較8月份收獲的龍葵葉片中各鎘轉(zhuǎn)運基因的表達水平差異，與重金屬鎘轉(zhuǎn)運有關(guān)的基因（p type-atpase）及合成金屬硫蛋白有關(guān)基因（hvmt-1，hvmt-3，hvmt-4）都隨鎘的積累明顯上調(diào)，這與重金屬鎘的誘導(dǎo)有關(guān)，龍葵通過上調(diào)鎘轉(zhuǎn)運基因的表達，更有效率地吸收土壤的養(yǎng)分及重金屬離子，導(dǎo)致龍葵體內(nèi)鎘的快速積累。另一方面，又通過上調(diào)合成金

18、屬硫蛋白相關(guān)基因表達，快速合成金屬硫蛋白螯合重金屬鎘離子，緩解減弱鎘對龍葵的損傷。endprint龍葵通過自身精細(xì)的調(diào)節(jié)，一邊有效吸收富集土壤中的鎘，一邊又快速合成相關(guān)蛋白消除或減弱鎘對自身的傷害，雖然植物抗鎘脅迫的機理已取得了階段性的進展41-42，但是還有許多細(xì)節(jié)的調(diào)控不清晰，目前未發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)特異轉(zhuǎn)運重金屬鎘的蛋白的相關(guān)報道，龍葵對鎘吸收及抗逆性精細(xì)調(diào)控信號通路也不完善，這都是未來要努力的方向。本研究針對超富集植物龍葵在對鎘污染響應(yīng)及土壤的修復(fù)有良好的效應(yīng)，對植物修復(fù)土壤中有害重金屬有借鑒意義。參考文獻：1周濤發(fā)，李湘凌，袁 峰，等. 金屬礦區(qū)土壤重金屬污染的植物修復(fù)研究現(xiàn)狀j. 地質(zhì)論

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