分子診斷技術在結核病診治中的應用

1、整理整理ppt分子診斷技術在結核病診分子診斷技術在結核病診治中的應用治中的應用整理整理ppt全球結核病流行狀況全球結核病流行狀況WHO report，2013整理整理ppt全球結核病流行狀況全球結核病流行狀況全球結核感染人數(shù)全球結核感染人數(shù)2004年后處于下降趨勢年后處于下降趨勢HIV患者并發(fā)結核病數(shù)量處于平穩(wěn)階段患者并發(fā)結核病數(shù)量處于平穩(wěn)階段中國結核感染人數(shù)全球排名第二中國結核感染人數(shù)全球排名第二WHO report，2013整理整理ppt全球結核病流行狀況全球結核病流行狀況WHO report，2013整理整理ppt全球結核病流行狀況全球結核病流行狀況全球結核死亡人數(shù)處于下降趨勢全球結核死

2、亡人數(shù)處于下降趨勢斯威士蘭結核病感染率最高斯威士蘭結核病感染率最高WHO report，2013整理整理ppt全球結核病流行狀況全球結核病流行狀況Globally, an estimated 3.6% of new cases and 20.2% of previously treated cases have MDR-TBThere were an estimated 450,000 new cases of MDR-TB worldwide in 2012On average, an estimated 9.6% of MDR-TB cases have XDR-TBWHO report，

3、2013整理整理ppt全球結核病流行狀況全球結核病流行狀況 2012年全球新發(fā)結核病例為年全球新發(fā)結核病例為860萬人，萬人，中國占總數(shù)的中國占總數(shù)的12%在在860萬新病例中約萬新病例中約110萬人（萬人（13%）為為HIV陽性，這些病例的陽性，這些病例的75%在非洲在非洲 每年約有每年約有130萬人死于結核病，我國萬人死于結核病，我國為為25萬萬 結核病每結核病每24秒鐘就殺死秒鐘就殺死1人人 預計未來預計未來20年還將有年還將有3600萬人死于結萬人死于結核病。核病。 全球每年有全球每年有45萬新發(fā)萬新發(fā)MDR-TB，大約，大約4.3萬為萬為 XDR-TB流流 行行現(xiàn)現(xiàn) 狀狀感染人數(shù)多感

4、染人數(shù)多死亡人數(shù)多死亡人數(shù)多耐藥患者多耐藥患者多潛伏感染多潛伏感染多“4多多”WHO report，2013整理整理ppt結核病診治中存在的問題結核病診治中存在的問題預防預防問題問題診斷診斷問題問題治療治療問題問題醫(yī)療醫(yī)療問題問題檢驗人員最關檢驗人員最關心的問題心的問題整理整理ppt根據(jù)不同分子水平及技術特點來選擇診斷檢測體系整理整理ppt細菌載細菌載體疫苗體疫苗DNADNA疫苗疫苗靈敏度靈敏度特異性特異性標本類型標本類型 目的用途目的用途費用費用實驗平臺實驗平臺 檢測時間檢測時間方法選擇方法選擇方法選擇的影響因素方法選擇的影響因素整理整理ppt孵育孵育4-8周周（陽性）（陽性）（陽性）（陽性

5、）涂陽涂陽=60-98%有結核分枝桿菌，有結核分枝桿菌，因此涂陽后最好用分子生物學因此涂陽后最好用分子生物學方法進行快速鑒定方法進行快速鑒定整理整理pptIGRAs、TST等等RNA水平水平DNA水平水平蛋白質水平蛋白質水平恒溫擴增恒溫擴增 變溫擴增變溫擴增 鑒定鑒定 鑒定鑒定+耐藥耐藥結核病分子結核病分子診斷診斷 擴增擴增 雜交雜交LAMP、SDA 芯片、芯片、RT-PCRSAT、TMAFISH、Probe整理整理ppt分子診斷適宜技術的選擇分子診斷適宜技術的選擇整理整理pptT-SPOT.TB與與 QFT-GI為為IGRAs實驗實驗潛伏性結核潛伏性結核（LTBILTBI）結核菌素試驗（結核

6、菌素試驗（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI)蛋白質水平蛋白質水平整理整理ppt全血全血IFN-釋放分析技術釋放分析技術(IGRA)結核感染者體內存在特異的效應結核感染者體內存在特異的效應T淋巴細胞，效應淋巴細胞，效應T淋巴細淋巴細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-）。）。因此，檢測效應因此，檢測效應T淋巴細胞可用于結核病或結核潛伏感染者淋巴細胞可用于結核病或結核潛伏感染者的診斷。的診斷。由于效應由于效應T細胞細胞存活時間很短存活時間很短，而且，而且具有特異性具有特異性，

7、因此可，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀。以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀?；诨贗GRA原理的產品目前已被原理的產品目前已被美國、加拿大、英國、德美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入等二十余個國家寫入本國的結核診療指南中本國的結核診療指南中整理整理ppt-干擾素釋放實驗干擾素釋放實驗酶聯(lián)免疫斑點技術酶聯(lián)免疫斑點技術培養(yǎng)濾液蛋白培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP 10）早期抗原靶早期抗原靶6（ESAT-6）一、一、T-SPOT技術基礎技術基礎整理整理ppt由結核桿菌基因組由結核桿菌基因

8、組RD1區(qū)區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在也不存在RD1區(qū)區(qū)結核桿菌特異抗原結核桿菌特異抗原ESAT-6與與CFP 10抗原抗原整理整理pptPlamaPBMCsGel BarrierErythrocytes檢測過程檢測過程分離分離PBMCs加入加入PBMCs與結核特異抗原與結核特異抗原37孵育孵育16-20小時小時PBMCs特異抗原特異抗原-干擾素抗體干擾素抗體加入標記二抗，孵育加入標記二抗，孵育1小時小時加入顯色液，終止反應加入顯色液，終止反應觀察結果：觀察

9、結果：1個斑點個斑點=1個效應個效應T細胞細胞整理整理ppt結果判斷圖結果判斷圖陰性結果陰性結果陽性結果陽性結果空白對照空白對照抗原抗原 AESAT-6抗原抗原 BCFP10陽性對照陽性對照（PHA）整理整理ppt潛伏性結核（潛伏性結核（LTBI）診斷技術比較）診斷技術比較IGRAs與TST相比，具有更高的靈敏度和特異性IGRAs與BCG, NTM無交叉反應，TST有交叉反應難以從感染者中鑒別出活動性肺結核患者小于5歲兒童、免疫力低下患者不適合采用IGRAs檢測試劑成本非常高整理整理ppt costs（費用）（費用） availability for clinicians and other

10、health workers（醫(yī)療水平）（醫(yī)療水平） patient acceptability（患者是否接受）（患者是否接受）ease of distribution and storage（實驗平臺）（實驗平臺） 整理整理ppt核酸擴增技術核酸擴增技術核酸擴增技術核酸擴增技術反應條件反應條件擴增產物擴增產物檢測方法檢測方法代表公司代表公司RT-PCR熱循環(huán)DNA實時RocheRT-LAMP恒溫DNAEikenGenoType MTBDRplus熱循環(huán)DNAHain LifescienceCPA恒溫DNA優(yōu)思達NASBA恒溫 RNAbioMerieuxTMA恒溫RNA終點Gen-ProbeS

11、AT恒溫RNA實時仁度SAT：Simultaneous Amplification and Testing (RNA仁度仁度) CPA: Cross Priming Amplification (DNA/RNA,優(yōu)思達優(yōu)思達)LAMP:Loop-Mediated Isothermal Amplification (DNA, Japan)TMA: Transcription Mediated Amplification (RNA, Gen-Probe)GenoType MTBDRplus：(Hain Lifescience) NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based

12、Amplification (RNA,OT) RCA: Rolling Circle Amplification (DNA, Molecular Staging) HDA：Helicase-Dependant Amplification (DNA, Biohelix, NEB)整理整理pptRNA 拷貝數(shù)拷貝數(shù) DNA拷貝數(shù)拷貝數(shù) 生命力旺盛的病原體生命力旺盛的病原體RNA轉錄活躍轉錄活躍較好的愈后指標較好的愈后指標交叉污染少交叉污染少RNA作為臨床分子診斷靶標作為臨床分子診斷靶標整理整理ppt二、二、SAT技術技術 同一溫度下（同一溫度下（42），以），以RNA為起始模板為起始模板，通過，通

13、過M-MLV反轉錄酶產生一反轉錄酶產生一個雙鏈個雙鏈DNA拷貝拷貝，然后利用，然后利用T7 RNA多聚酶多聚酶從從DNA拷貝上產生多個（拷貝上產生多個（1001000個）個）RNA拷貝；每一個拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環(huán)；拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標記的同時，帶有熒光標記的探針探針和這些和這些RNA拷貝特異結合，產生熒光。該熒光信拷貝特異結合，產生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環(huán)情況號可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環(huán)情況RNA(+)Forward PrimerRTRNase H activityRevers

14、e PrimerRTT7100-1000 copiesMolecular BeaconReverse PrimerForward PrimerRT/RNase H activityRNA(+)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(+)RNA(-)RNA(-)RNA(-)DNA(+)DNA(+)整理整理pptTB-SAT操作步驟操作步驟陽性結果陽性結果陰性結果陰性結果恒溫擴增 -42CRNA 檢測 -起始靶標與擴增產物都是RNA擴增產物的污染更少 -RNA環(huán)境中易降解更高的擴增效率-30分鐘內擴增10億倍反應穩(wěn)定 - 抑制物少高靈敏度、特異性活菌檢測操作簡單、快速整理整理ppt

15、整理整理pptMTBDRsl-鑒定鑒定XDRMTBDRplus-鑒定鑒定MDRMTBC-鑒定鑒定MTB復合群復合群MTBCM-鑒定鑒定MTB和和NTMGene-Probe(TMA/Hain)技術技術整理整理ppt三、三、MTBC-鑒定鑒定MTB復合群復合群(TMA技術技術)方法名稱：方法名稱： HPV（Hybridization Protection Assay）-雜交保護分析法為雜交保護分析法為Gen-probe公司專利公司專利原理：原理： 以以rRNA為靶標，采用線性探針技術檢測結核分枝桿菌復合群為靶標，采用線性探針技術檢測結核分枝桿菌復合群檢測設備：檢測設備： LEADER 50iHPA

16、-MTD(Mycobacterium Tuberculosis Direct): 2.5h 報告，直接從標本中檢測結核菌報告，直接從標本中檢測結核菌HPA-Accuprobe: 1h 報告，用菌落或自動培養(yǎng)系統(tǒng)的菌報告，用菌落或自動培養(yǎng)系統(tǒng)的菌整理整理ppt樣本樣本細胞溶解細胞溶解目標目標 r-RNA釋放釋放MTD技術路線技術路線雜交體雜交體rRNAAEAEAEAEAEAEAEAE60C15分鐘分鐘加入探針加入探針探針探針雜交雜交AEAEAE選擇性試劑選擇性試劑60C化學發(fā)光讀數(shù)儀化學發(fā)光讀數(shù)儀 熒光檢測熒光檢測整理整理pptMTD技術特點技術特點整理整理pptMTD結核分枝桿菌檢測技術特點結

17、核分枝桿菌檢測技術特點n采用分子技術快速鑒定（2.5小時小時）結核分枝桿菌復合群n標本可以是涂片陰性或者陽性涂片陰性或者陽性的痰標本；也可以是培養(yǎng)物n唯一獲得FDA推薦推薦的凃陰樣本快速檢測技術n檢測RNA，RNA只能來源于活的細菌，可鑒定活動性結核病人）n采用TMA恒溫擴增恒溫擴增，不使用PCR儀器，無需專業(yè)的PCR實驗室認證nHPA雜交保護分析技術：靈敏、特異靈敏、特異n嚴格的實驗室防污染技術實驗室防污染技術：整個實驗過程所有試劑和樣本全部在同一個反應管內進行，杜絕交叉污染整理整理pptMTD結核分枝桿菌的直接檢測意義結核分枝桿菌的直接檢測意義nTB與其他分枝桿菌區(qū)分與其他分枝桿菌區(qū)分 A

18、IDS患者鳥分枝桿菌小腸黏膜感染患者鳥分枝桿菌小腸黏膜感染 龜分枝桿菌引起嚴重院內感染（南方某醫(yī)院）龜分枝桿菌引起嚴重院內感染（南方某醫(yī)院）n提高提高TB檢出率檢出率 CSF、胸腹水等、胸腹水等n疑似患者疑似患者 長期低熱、長期低熱、ESR持續(xù)增快，排除腫瘤和免疫性疾病患者，持續(xù)增快，排除腫瘤和免疫性疾病患者，做血、痰做血、痰TB菌菌MTD檢測檢測整理整理pptDNA作為臨床分子診斷作為臨床分子診斷靶標靶標整理整理ppt四、四、MTBDRplus-鑒定鑒定MDR方法名稱：方法名稱： 耐多藥結核病耐多藥結核病(MDR-TB)快速診斷為快速診斷為Hain Lifescience公司公司專利專利原理

19、：原理： 采用采用線性探針技術線性探針技術（Line-Probe或稱或稱DNA-Strip）檢測結核分枝桿菌復）檢測結核分枝桿菌復合群合群利福平利福平(rpoB)和異煙肼和異煙肼(katG和和inhA)等結核治療藥物的等結核治療藥物的耐藥基因耐藥基因來來判斷判斷TB體內耐藥性體內耐藥性MTBDRplus: 6h報告結核分枝桿菌復合群鑒定與耐藥結果報告結核分枝桿菌復合群鑒定與耐藥結果整理整理ppt抗 結 核藥物 靶基因 編碼的產物 靶區(qū)域和突變率 最常見突變位點 耐藥水平 RFPrpoBRNA聚合酶亞單位RRDR 81 bp，95Codon531，30-75高INHkatG過氧化氫酶-過氧化物酶

20、整個基因，60-95S315T，60-95高INHinhA烯?；€原酶調節(jié)區(qū)，25inhA-15低INHa h p C -Promoter過氧化物酶啟動區(qū)，12%低PZApncA吡嗪酰胺酶整個基因，68-97無特定位點高EMBembB阿拉伯糖基轉移酶ERDR少數(shù)密碼子， 47-94Codon306，47-89高SMrpsL核糖體蛋白S12Codons 43 和88， 40-95K43R，40-90高SMrrs16S rRNA多個堿基，29%513位、905位堿基，各占10.3%低喹 諾 酮類gyrAgyrBDNA旋轉酶67106位,75-94%Codon90,94高結核耐藥結核耐藥的分子的分子

21、機制機制整理整理pptMTBDRplus技術路線技術路線DNA提取提取PCR擴增擴增探針雜交探針雜交結果判讀結果判讀整理整理ppt結果解釋結果解釋 野生型：有雜交帶顯色為野生型：有雜交帶顯色為“+”，表示未發(fā)生突變，表示未發(fā)生突變 耐藥突變位點：有雜交帶顯耐藥突變位點：有雜交帶顯色為色為“+”，表示發(fā)生突變，表示發(fā)生突變 敏感：所有野生型探針敏感：所有野生型探針“+”和所有耐藥位點探針和所有耐藥位點探針“-” 耐藥：對應藥物有耐藥：對應藥物有1條野生條野生型探針型探針“-”或有或有1條耐藥位點條耐藥位點“+”整理整理ppt 優(yōu)勢優(yōu)勢快速檢測快速檢測RFP和和INH的耐藥的耐藥時間短、操作簡單、

22、安全高時間短、操作簡單、安全高 特異性和靈敏度較高、重復性好特異性和靈敏度較高、重復性好主觀因素影響小、更為可靠主觀因素影響小、更為可靠不足不足不能檢測所有藥物的耐藥基因型不能檢測所有藥物的耐藥基因型缺少缺少ahpC-oxyR間隔序列范圍間隔序列范圍不能取代傳統(tǒng)細菌學檢測、只能不能取代傳統(tǒng)細菌學檢測、只能作為參考作為參考技術特點技術特點MTBDRplus技術技術整理整理ppt方法方法結果結果比例法藥敏結果比例法藥敏結果耐藥耐藥敏感敏感靈敏度（靈敏度（% %）特異度（特異度（% %）符合率（符合率（% %）MTBDRplusRFP耐藥耐藥48098.0100.098.5敏感敏感116RFP（涂陽

23、）耐藥耐藥391295.192.192.7敏感敏感2140INH耐藥耐藥45086.5100.089.7敏感敏感716INH（涂陽）耐藥耐藥63098.4100.099.5敏感敏感1129MTBDRplus技術性能參數(shù)技術性能參數(shù)J Clin Microbiol. 2010 Aug;45(8):2635-40. Epub 2007 May 30整理整理pptMTBDRplus技術性能參數(shù)技術性能參數(shù)中國人群存在一定中國人群存在一定數(shù)量的數(shù)量的KatG S315N突變突變整理整理pptnWHO、蓋茨基金會推薦使用的快速線性探針技術，可以在6小時小時內給出藥敏鑒定結果n可以做一線結核藥物一線結核藥

24、物（異煙肼 利福平）、二線結核藥物二線結核藥物的耐藥檢測（乙胺丁醇、氟喹諾酮類藥物、可注射結核藥物）n標本可是涂片陽性的痰標本痰標本，或是培養(yǎng)物培養(yǎng)物n技術步驟簡單技術步驟簡單：核酸提取、PCR擴增、核酸雜交儀檢測n每個試劑條上自帶質控：CC雜交質控、AC擴增質控、TUB結核分枝桿菌質控，確保整個實驗流程的可信度可信度 HAIN-結核分枝桿菌耐藥快速檢測系統(tǒng)特點結核分枝桿菌耐藥快速檢測系統(tǒng)特點整理整理ppt五、交叉引物恒溫擴增技術五、交叉引物恒溫擴增技術 (Cross Priming Amplification, CPA) 本試劑盒將病原體本試劑盒將病原體DNA擴增、核酸雜交和核酸試擴增、核酸

25、雜交和核酸試紙條檢測三種技術有機地融為一體，在恒溫擴增反紙條檢測三種技術有機地融為一體，在恒溫擴增反應中加入應中加入兩對兩對TB特異性引物、一對特異性探針特異性引物、一對特異性探針，同，同時一次性完成時一次性完成TB DNA的擴增及雜交過程，然后用的擴增及雜交過程，然后用3號一次性號一次性核酸檢測裝置核酸檢測裝置對對TB感染進行定性診斷，其感染進行定性診斷，其檢測檢測靈敏度為靈敏度為10個病原體，高特異引物個病原體，高特異引物設計確保了設計確保了結果的可靠性。由于待測樣本的擴增（結果的可靠性。由于待測樣本的擴增（PCR管蓋和管蓋和石蠟油雙重保護）和檢測過程均在石蠟油雙重保護）和檢測過程均在物理

26、封閉條件物理封閉條件下下完成，所以本試劑盒具有防止實驗室擴增物完成，所以本試劑盒具有防止實驗室擴增物交叉污交叉污染染，防止假陽性的效果，防止假陽性的效果杭州優(yōu)思達公司杭州優(yōu)思達公司整理整理pptCPA技術原理圖技術原理圖A:引入交叉引入交叉引物位點引物位點B:交叉引交叉引物擴增物擴增C:檢測產物檢測產物整理整理pptCPA技術路線圖技術路線圖核酸提取核酸提取痰液痰液石蠟油石蠟油反應液反應液試劑配制試劑配制63 2恒溫擴增恒溫擴增金屬浴金屬浴防污染檢測裝置防污染檢測裝置取出反應管取出反應管15-30分鐘分鐘讀取結果讀取結果整理整理ppt有色顆粒有色顆?？箍笰抗體抗體雙重標記的雙重標記的特異性擴增

27、物特異性擴增物陽性陽性抗抗體抗抗體有色顆粒有色顆?？箍笰抗體抗體停留，顯色停留，顯色試紙條檢測結果判讀原理圖試紙條檢測結果判讀原理圖抗體包被的顆?？贵w包被的顆粒有色顆粒有色顆粒抗抗A抗體抗體陰性陰性無特異性擴增物無特異性擴增物抗抗體抗抗體有色顆粒有色顆?？箍笰抗體抗體無抗抗原無抗抗原有色顆粒流出有色顆粒流出停留，但無色停留，但無色整理整理ppt結果的判讀結果的判讀n 陽性：陽性：試紙條出現(xiàn)試紙條出現(xiàn)兩條紅色條帶兩條紅色條帶，一條位于質控區(qū)（，一條位于質控區(qū)（C C線），一條位于線），一條位于檢測檢測 區(qū)（區(qū)（T T線）且其強度線）且其強度L4L4（與附帶的色卡比較）。表明樣本中含有（與附帶的色

28、卡比較）。表明樣本中含有結核分枝桿菌，且其水平達到或超過本試劑盒的最低檢出限結核分枝桿菌，且其水平達到或超過本試劑盒的最低檢出限n 陰性陰性：試紙條質控區(qū)（試紙條質控區(qū)（C C線）出現(xiàn)一線）出現(xiàn)一條紅色條帶條紅色條帶，檢測區(qū)（，檢測區(qū)（T T線）沒有條線）沒有條帶或者其強度帶或者其強度L4L4（與附帶的色卡比較）。表明樣本中不含結核分枝桿菌，（與附帶的色卡比較）。表明樣本中不含結核分枝桿菌，或其水平低于本試劑盒的最低檢出限或其水平低于本試劑盒的最低檢出限n 無效無效：試紙條質控區(qū)（試紙條質控區(qū)（C C線）線）未出現(xiàn)條帶未出現(xiàn)條帶。表明試劑盒已損壞、失效或。表明試劑盒已損壞、失效或者操作有誤者操

29、作有誤恒溫擴增恒溫擴增-CPA整理整理pptCAP技術技術CPA的優(yōu)勢：快速，簡單，靈活，穩(wěn)定的優(yōu)勢：快速，簡單，靈活，穩(wěn)定ffordable低價低價: 不需昂貴的設備和分子實驗室不需昂貴的設備和分子實驗室Sensitive靈敏：靈敏：10個菌個菌/ml；與快培比較：；與快培比較：87%Specific特異：能鑒別人型和牛型特異：能鑒別人型和牛型結核分枝桿菌結核分枝桿菌User-friendly容易使用：不需容易使用：不需PCR儀儀, 操作簡單操作簡單Rapid/robust快速快速/穩(wěn)定：樣本到結果穩(wěn)定：樣本到結果2小時小時Equipment-free無儀器：僅需離心機、水浴鍋或金屬浴無儀器

30、：僅需離心機、水浴鍋或金屬浴Deliverable易儲運：不需冷鏈運輸。裝置易儲運：不需冷鏈運輸。裝置可儲存于室溫可儲存于室溫ASSURED 整理整理pptCPA技術性能參數(shù)技術性能參數(shù)整理整理ppt六、環(huán)介導恒溫擴增技術六、環(huán)介導恒溫擴增技術 (Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP ) 環(huán)介導恒溫擴增法是日本榮研化學獨立研發(fā)的一種環(huán)介導恒溫擴增法是日本榮研化學獨立研發(fā)的一種“簡便、快速、準簡便、快速、準確、廉價確、廉價”的基因擴增方法。它的特征是針對目標的基因擴增方法。它的特征是針對目標DNA鏈上的鏈上的六個區(qū)段六個區(qū)段設計設計四個不同的引物

31、四個不同的引物，然后再利用，然后再利用鏈置換反應鏈置換反應在一定溫度下進行反應。在一定溫度下進行反應。反應只需要把基因模板、引物、鏈置換型反應只需要把基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質等共同置于合成酶、基質等共同置于一定溫度下一定溫度下（60-65）、經一個步驟即可完成。擴增效率極高，可在）、經一個步驟即可完成。擴增效率極高，可在15min-1h內實現(xiàn)內實現(xiàn)109-1010倍的擴增。而且由于有著高度的特異性，只需根倍的擴增。而且由于有著高度的特異性，只需根據(jù)擴增反應產物的有無可對靶基因序列的存在與否作出判斷據(jù)擴增反應產物的有無可對靶基因序列的存在與否作出判斷 不需要使雙鏈不需要使雙鏈D

32、NA先變性成單鏈先變性成單鏈 擴增反應在擴增反應在等溫等溫下可持續(xù)進行下可持續(xù)進行 擴增擴增效率極高效率極高 針對六個區(qū)段使用兩種不同的引物，可特異性擴增靶基因序列針對六個區(qū)段使用兩種不同的引物，可特異性擴增靶基因序列 僅使用一種鏈置換僅使用一種鏈置換DNA聚合酶，聚合酶，成本低廉成本低廉 擴增產物是在同一條擴增產物是在同一條DNA鏈上互補序列周而復始形成大小不一鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結構的結構 當模板是當模板是RNA時，僅需加入時，僅需加入逆轉錄酶逆轉錄酶即可與即可與DNA一樣進行擴增一樣進行擴增整理整理pptLAMP技術原理動畫圖技術原理動畫圖整理整理ppt整理整理pptLAM

33、P方法建立階段所需的試劑方法建立階段所需的試劑 DNA 擴增擴增 RNA擴增擴增 n模板模板DNAn引物引物FIPF3BIPB3nBstDNA 聚合酶聚合酶ndNTPsn反應緩沖液反應緩沖液n模板模板RNAn引物引物FIPF3BIPB3nBstDNA 聚合酶聚合酶n逆轉錄酶逆轉錄酶ndNTPsn反應緩沖液反應緩沖液整理整理pptLAMP技術結果判讀原理圖技術結果判讀原理圖LAMP法結果判斷方式法結果判斷方式-目視檢查混濁目視檢查混濁 LAMP法結果判斷方式法結果判斷方式/-目視檢查綠色熒光目視檢查綠色熒光/濁度檢測儀濁度檢測儀 整理整理pptn 擴增反應在等溫條件（擴增反應在等溫條件（6065

34、）下連續(xù)進行）下連續(xù)進行 可以使用簡便、廉價的擴增裝置可以使用簡便、廉價的擴增裝置n 擴增效率高、可在短時間內完成擴增擴增效率高、可在短時間內完成擴增 可在短時間內得出結果可在短時間內得出結果n 有非常高的特異性有非常高的特異性 可得出可得出“擴增反應發(fā)生擴增反應發(fā)生=有目的菌存在有目的菌存在”的結論的結論n 產生大量擴增產物，檢測方法簡便產生大量擴增產物，檢測方法簡便 無需用電泳、特殊探針等，可通過濁度儀、熒光目視無需用電泳、特殊探針等，可通過濁度儀、熒光目視 方法確認擴增結果方法確認擴增結果n 從擴增到檢測可在從擴增到檢測可在1個反應試管內（封閉系統(tǒng)）完成個反應試管內（封閉系統(tǒng)）完成 可防

35、止由于擴增產物產生的污染可防止由于擴增產物產生的污染n 從從RNA經一步反應可完成擴增經一步反應可完成擴增 無需另外進行逆轉錄反應無需另外進行逆轉錄反應LAMP技術特點技術特點整理整理pptLAMP技術的應用領域技術的應用領域 食品領域食品領域 食物中毒致病菌的檢測食物中毒致病菌的檢測 食品的衛(wèi)生管理食品的衛(wèi)生管理 食物中毒的防止食物中毒的防止 臨床領域臨床領域 病原菌病原菌、病毒的檢測及鑒定病毒的檢測及鑒定 通過通過SNP多態(tài)性分型決定用多態(tài)性分型決定用藥量藥量 農業(yè)領域農業(yè)領域 植物病害的早期發(fā)現(xiàn)植物病害的早期發(fā)現(xiàn)及蔓延防止及蔓延防止 轉基因作物的檢測轉基因作物的檢測 環(huán)境領域環(huán)境領域 環(huán)

36、境、水中病原微生物的檢環(huán)境、水中病原微生物的檢測測 工業(yè)領域工業(yè)領域 工業(yè)產品用大量工業(yè)產品用大量DNA的生的生產成為可能產成為可能 畜牧業(yè)領域畜牧業(yè)領域 雌雄性別判斷雌雄性別判斷 病原微生物的檢測病原微生物的檢測 遺傳病的發(fā)現(xiàn)遺傳病的發(fā)現(xiàn)整理整理pptLAMP技術性能參數(shù)技術性能參數(shù)整理整理ppt七、七、DNA微陣列（基因芯片）技術微陣列（基因芯片）技術 DNA微陣列或芯片技術是利用光導化學合成、照相平板印刷以及固相微陣列或芯片技術是利用光導化學合成、照相平板印刷以及固相表面化學合成等技術，在固相表面合成成千上萬個表面化學合成等技術，在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸探針，或將寡核苷酸探針，或

37、將液相合成的探針液相合成的探針由微陣列器或機器人點樣于由微陣列器或機器人點樣于尼龍膜或硅片尼龍膜或硅片上，再與上，再與放射放射性同位素或熒光物標記的性同位素或熒光物標記的DNA或或cDNA雜交雜交，用于分析，用于分析DNA突變及多態(tài)突變及多態(tài)性、性、DNA測序、監(jiān)測同一組織細胞在不同狀態(tài)下多種組織細胞基因表達測序、監(jiān)測同一組織細胞在不同狀態(tài)下多種組織細胞基因表達水平的差異、發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關基因等多個研究領域水平的差異、發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關基因等多個研究領域博奧生物博奧生物整理整理ppt基因芯片技術操作流程基因芯片技術操作流程樣品制備樣品制備試劑配制試劑配制雜交雜交激光共焦掃描激

38、光共焦掃描軟件判讀軟件判讀整理整理pptr分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法）微陣列芯片法）同時快速檢測同時快速檢測 17 種分枝桿菌：結核、胞內、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、種分枝桿菌：結核、胞內、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜龜-膿腫、草、不色、海膿腫、草、不色、海-潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍及恥垢。潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍及恥垢。分離株或者痰樣本均可檢測。分離株或者痰樣本均可檢測。 通通 量：量：同時檢測同時檢測 17 種分枝桿菌種分枝桿菌速速 度：度：6小時小時 versus 傳統(tǒng)傳統(tǒng) 4 周周靈敏度：靈敏度： 103 CFU/反應反應特異性：防污染體系；對照設計嚴謹；自動判讀特異性：防污染體系；對照設計嚴謹