慢病毒載體包裝構(gòu)建過程

1、慢病毒載體包裝構(gòu)建過程原理：慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的 shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長期、穩(wěn)定表達。概念：慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1 (H IV-1)來源的一種病毒載體，慢病毒載體

2、包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載體系統(tǒng)的主要組成部分。攜帶有 外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的慢病毒包裝質(zhì)粒和可產(chǎn)生病毒顆粒的細胞系。電:敘* -"入啊切Lentivrrai RftfAj System病毒顆粒，通過感染細胞或活體組織，實現(xiàn)外源基因在細胞或活體組織中表達。輔助成分：慢病毒載體輔助成分包括:慢病毒載體包含了包裝、 轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中進

3、行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后， 可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應(yīng)分子?；驹恚郝《据d體系統(tǒng)由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分：由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白。包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個質(zhì)粒上，一個質(zhì)粒表達Gag和Pol蛋白，另一個質(zhì)粒表達Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。將包裝成分與載體成分的3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞（如人腎293T細胞），即可在細胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復(fù)

4、制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。載體成分：與包裝成分互補，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組恢復(fù)成野生型病毒的可能，需盡量減少二者的同源性，如將包裝成分上5' LTFB成巨細胞病毒（CMV）立即早期啟動子、3' LTR換成SV40 polyA等。j J1一攜膏目的基因的轉(zhuǎn)程魅體與 2收集精毒3#毒耙異削蜩陷4一目割基因整合包尖鑫悻共轉(zhuǎn)果包蕓切脂葬表達實驗流程（1和2為并列步驟）1. 慢病毒過表達質(zhì)粒載體的構(gòu)建設(shè)計上下游特異性擴增引物，同時引入酶切位點，PCR鴕用高保真

5、KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%）從模板中（CDNA質(zhì)粒或者文庫）調(diào)取目的基因 CDS區(qū)（coding sequence）連入T載體。 將CDS區(qū)從T載體上切下，裝入慢病毒過表達質(zhì)粒載體。2. 慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建合成siRNA對應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24和48h后，分別收集富含 慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。二、實驗材料2.1慢病毒載體、包裝細胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒

6、系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2其中質(zhì)粒上的ZsGreen 1表達框能表達綠色熒光蛋白（ GFP3）。載體信息1）慢病毒克隆載體圖譜如下：pLVX-IRES-ZsGroon 1 Voctor InformationCataWPRE ZsGreenXMlHoti匚Rlpel XbalDon訂 II2801 GTGAATTCCT CGAGACTAGT TCTAGAGCGG CCGCGGATCCCACTTAAGGA GCTCTGATCA AGATCTCGCC GGCGCCTAGGpLVX IRES ZGrecnl Vector Map and Multiple Cloning Site (MCS).5' LTREroIUGC11CGAAT1 C1AG11AT1ACGAAGCTTAA GATGGCCCATRnmHI2431 AAGGACGAGG ATCCGGACAATTCCTGCTCC TAGGCCTGTT2）包裝質(zhì)粒信息如下:PMD2G載體圖譜和序列信息PSPAX22體圖譜和序列信息：DMEM（含用于擴增細胞株293T,慢病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，生長培養(yǎng)基為10% FBS貼壁細胞經(jīng)