分子診斷技術(shù)的應用進展張健

1、從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質(zhì)基礎(chǔ)的學科。研究細胞成分的物理、化學的性質(zhì)和變化以及這些性質(zhì)和變化與生命現(xiàn)象的關(guān)系，如遺傳信息的傳遞，基因的結(jié)構(gòu)、復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達調(diào)控和表達產(chǎn)物的生理功能，以及細胞信號的轉(zhuǎn)導等。根據(jù)目的基因是否被放大分類根據(jù)目的基因是否被放大分類可分為雜交法和擴增法根據(jù)被測基因的核酸類型分類根據(jù)被測基因的核酸類型分類Southern印跡用于檢測DNA；Northern印跡用于檢測RNA；斑點印跡或稱斑點雜交，既可檢測DNA也可檢測RNA。根據(jù)診斷目的或要求根據(jù)診斷目的或要求分為定性診斷、定量診斷和半定量診斷，以及序列分析等根據(jù)分子之間的作用形式雜交、擴增、測序基于分子雜交為基

2、礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)發(fā)展及其應用基于分子雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)發(fā)展及其應用兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補的原則下形成異質(zhì)雙鏈是遺傳物質(zhì)最重要的化學特征，這一過程亦被稱為分子雜交（molecular hybridization）。分子雜交是所有分子生物學技術(shù)的基礎(chǔ)，從最初的印跡雜交（southern Blot和northern Blot）到實時PCR（real time PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術(shù)，都離不開堿基互補的分子雜交反應。而且在理論上可以特異性相互作用的兩個不同分子，例如核酸與核酸之間（A-G、G-C）、蛋白與蛋白之間（抗原和抗體）甚至核酸和蛋白之間（

3、適體與多肽）的相互作用都可以視為分子雜交的不同表現(xiàn)模式。因此，廣義的分子雜交技術(shù)是指以核酸、蛋白、糖基以及細胞、代謝物等分子的相互作用所建立的分析方法。目前臨床應用的以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的診斷技術(shù)繁多，缺乏統(tǒng)一的分類方法，但是可以根據(jù)實驗方法的差異分為主要的兩種類型，一類是通過特異性的標記探針檢測檢測細胞內(nèi)的核酸物質(zhì)，而另一類是通過探針檢測從細胞內(nèi)提取的核酸、蛋白等物質(zhì)，前者以原位雜交及其衍生的技術(shù)為主，后者以生物芯片及其衍生的技術(shù)為主。原位雜交應用特異性的探針檢測細胞內(nèi)的核酸需要標記分子顯示雜交信號，1960s年代的檢測技術(shù)是放射性核素標記，但是信號檢測程序復雜并且可能存在放射性物質(zhì)的污染，

4、而熒光物質(zhì)標記可以通過顯微鏡直接觀察實驗結(jié)果，因此熒光標記的原位雜交技術(shù)（Fluorescent in situ hybridiztion，F(xiàn)ISH）一經(jīng)出現(xiàn)立刻取代了放射性標記的技術(shù)，成為應用最廣泛的分子雜交技術(shù)。FISH技術(shù)通過熒光標記探針，可以可視化的檢測人類細胞或組織中特定基因的數(shù)量及其定位，是分子雜交與細胞遺傳學技術(shù)的結(jié)合。IFSH技術(shù)的分析過程分為四個步驟，核酸變性、探針變性、雜交及信號檢測。因此，針對探針標記、染料開發(fā)和圖像分析的技術(shù)的更新是FISH分析技術(shù)發(fā)展的主要路徑。首先是熒光染料的應用，從最初的單色FITC應用，發(fā)展到使用多種熒光染料的多色FISH技術(shù)，既多元熒光原位雜交

5、和光譜核型分析技術(shù)，使用五種染料（Rhodamine, Texas-red, Cy5, FITC, and Cy5.5）標記的探針可以在一次試驗中定位多種不同的基因以及使用不同的顏色標記顯示24條不同的染色體。其次，在探針方面，染色體臂、著絲粒、端粒特異的探針被先后開發(fā)應用，而且應用微切割技術(shù)切割技術(shù)制備亞區(qū)域探針（microFISH），使FISH的基因定位和分辯率大大提高6。同時，探針標記對象和標記技術(shù)的發(fā)展不斷衍生出新的FISH技術(shù)，例如比較基因組雜交、引物原位標記技術(shù)、肽核酸探針原位雜交、物種交叉熒光原位雜交、纖維原位雜交等。在圖像與信號分析方面，應用高分辨率CCD攝像機和計算機自動圖像

6、分析系統(tǒng)獲得廣泛應用，而SKY結(jié)合傅立葉頻譜技術(shù)，同時計量可見光和近紅外范圍內(nèi)的所有點的發(fā)射頻譜而一次成像。JournalofCellScience2003；116（14）在產(chǎn)前診斷方面，F(xiàn)ISH主要用于染色體數(shù)目異常的診斷，與常規(guī)核型分析的一致性可以達到99.5，但結(jié)果報告時間只要24小時，大大低于核型分析的平均2周左右的報告時間，F(xiàn)ISH在多數(shù)的發(fā)達國家已經(jīng)批準為常規(guī)產(chǎn)前篩查輔助診斷技術(shù)。在血液腫瘤的診斷方面，F(xiàn)ISH用于染色體異位的融合基因檢測、基因缺失檢測、微小殘留病灶監(jiān)測、骨髓移植監(jiān)測等。在感染性疾病檢測方面，F(xiàn)ISH檢測痰液標本中銅綠假單飽菌、流感嗜血桿菌等常見菌的敏感性可以達到9

7、0，特異性1009。對于軍團菌、幽門螺旋桿菌和結(jié)核桿菌等較難培養(yǎng)鑒定的細菌，F(xiàn)ISH在快速診斷上也顯示了很好的應用前景。在實體腫瘤的應用中，F(xiàn)ISH可以檢測任何組織類型的染色質(zhì)和基因的異常，廣泛應用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌等實體腫瘤的腫瘤的輔助診斷，療效檢測、個體化治療和預后判斷。FISH用于藥物靶向性基因表達狀態(tài)的檢測。在乳腺癌治療藥物曲妥珠單抗(赫賽汀)治療有效性患者篩選中，F(xiàn)ISH被認為是檢測HER2基因表達狀態(tài)的金標準。生物芯片（Biochip）是通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)將大量特定序列的寡合苷酸片段、抗原/抗體，甚至細胞或組織等生物大分子，按照矩陣方式高密度的固定或直接合成在玻

8、璃、硅片、聚丙烯、磁性微球等固項支持物上，或者整合微流體技術(shù)以及微電級、為傳感器等制備的類似于電子行業(yè)的芯片樣產(chǎn)品的檢測技術(shù)。固化的探針分子與熒光標記的相應樣本進行雜交，通過熒光檢測系統(tǒng)掃描分析及計算機軟件分析，達到高通量分析生物信息的目的。生物芯片技術(shù)可以根據(jù)功能的不同分為微陣列芯片（Microarraychip）、微流控芯片（Microfluidics）和芯片實驗室（LAB-on-chip,LOC）。微陣列芯片：早期的微陣列芯片（Microarray）單指基因芯片（genechip，DNAchip），但隨著蛋白芯片（proteinchip）以及糖類芯片（glycanchip）的出現(xiàn)，Mic

9、roarray逐漸被稱為微陣列芯片，強調(diào)將大量探針有序固化在固相支持物上的檢測方法，而根據(jù)探針種類的不同可以分為基因芯片、蛋白芯片及糖類芯片。生物芯片技術(shù)可以根據(jù)功能的不同分為微陣列芯片（Microarraychip）、微流控芯片（Microfluidics）和芯片實驗室（LAB-on-chip,LOC）。微流控芯片：是在幾平方厘米的單晶硅片、石英、玻璃或有機聚合物等材料上刻制微通道，實現(xiàn)樣本預處理、反應、分離和檢測的微型檢測平臺，可快速高效、高通量的完成基因、蛋白及各種小分子分析和鑒定芯片實驗室：是在微流控芯片基礎(chǔ)上發(fā)展了更為復雜的分析系統(tǒng)，將微機電技術(shù)于微流體技術(shù)相結(jié)合，將所需的反應均集中

10、在一塊芯片上，建立微型分析系統(tǒng)（Micrototalanalyticalsystem，u-TAS）目前生物芯片可以應用的范圍包括：病原體的快速檢測、亞型分析及耐藥性檢測；腫瘤的分類、分期與篩查；遺傳性疾病的診斷于篩查；自身免疫性疾病的診斷等等。國外的生物芯片開發(fā)較早，許多成熟的生物芯片的檢測平臺已逐漸應用于臨床，例如美國Osmetch公司的e-SensorCFtest（檢測Cysticfibrosis）和RocheAffymetrix的CYP450芯片（檢測藥物代謝相關(guān)基因CYP2D6和CYP2C19），Agendia公司的Mammaprint芯片（檢測乳腺癌相關(guān)基因），這三種芯片均已獲得美國

11、FDA的批準應用于臨床實驗室名稱主要用途簡并引物擴增法擴增未知基因片斷巢式PCR提高pcr敏感性、特異性，分析突變多重PCR同時檢測多個突變或病原反向PCR擴增已知序列兩側(cè)的未知序列，致產(chǎn)物突變單一特異引物PCR擴增未知基因組DNA單側(cè)引物PCR通過已知序列擴增未知cDNA原位PCR研究基因表達錨定PCR分析具備不同末端的序列以擴增為基礎(chǔ)的方法的臨床應用DNA或RNA的擴增技術(shù)，最直接的優(yōu)勢是在較短的時間內(nèi)將目的基因的拷貝數(shù)大量擴增，具有很高的靈敏度，同時特異性的引物保證了較高的特異性。因此，在分子診斷技術(shù)中基于擴增的技術(shù)，特別是熒光定量PCR技術(shù)，在實驗診斷中應用最為廣泛。PCR技術(shù)可以準確

12、的定量感染性疾病病原體，不論是真菌、細菌和病毒以及寄生蟲的感染都可以應用擴增技術(shù)加以檢測，同時同一種病原體可以買到多種擴增原理的商業(yè)化檢測試劑。目前在sFDA注冊的應用PCR方法的體外診斷試劑已達到190余種，成為病原體和基因表達與突變檢測的最主要的試劑。為提高PCR的檢測通量，新進發(fā)展的多重PCR技術(shù)以及多重連接探針擴增技術(shù)（Multiplexligation-dependentProbeamplification，MLPA）可以一次在同一樣本中同時檢測多種病原體，最大可同時擴增45個目的片段。同時，對PCR產(chǎn)物的高分辨率溶解曲線分析，為基因分型和突變掃描提供了新的手段?？梢灶A見PCR技術(shù)仍

13、將主導臨床實驗室感染性病原體的檢測，細菌的耐藥基因檢測，腫瘤個體化治療的主要檢測工具。5 5DNA分子被隨機切割成小片段體內(nèi)克隆擴增電泳(每次電泳讀取一個堿基信息)第一個堿基是什么？第二個堿基是什么？第三個堿基是什么？芯片循環(huán)測序(每個芯片可以獲得長度超過106bp的序列)循環(huán)測序模板引物制成polony芯片體外接頭連接DNA分子被隨機切割成小片段ab聚合酶dNTPs熒光標記的ddNTP芯片循環(huán)測序1芯片循環(huán)測序2芯片循環(huán)測序3圖1傳統(tǒng)的Sanger測序法及新一代DNA測序技術(shù)工作流程圖。（a）高通量鳥槍Sanger測序法。首先基因組DNA被隨機切割成小片段分子，接著眾多小片段DNA被克隆入質(zhì)

14、粒載體，隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。最后培養(yǎng)大腸桿菌提取質(zhì)粒，進行測序。每一個測序反應都在只有幾微升的反應體系中完成。測序后獲得一系列長短不一的末端標記有熒光的片段，最后通過對每一個延伸反應產(chǎn)物末端熒光顏色進行識別來讀取DNA序列。（b）鳥槍循環(huán)芯片測序法。首先將基因組DNA隨機分割成小片段DNA分子，然后在這些小片段DNA分子的末端連接上普通的接頭，最后用這些小片段DNA分子制成polony芯片。每一個polony中都含有一個小片段DNA分子的許多個拷貝。許多這樣的polony集合在一起就形成了polony芯片。這樣一次測序反應就可以同時對眾多的polony進行測序。然后與sanger法中一樣，通

15、過對每一個延伸反應產(chǎn)物末端熒光顏色進行識別來讀取出DNA序列。重復上述步驟就能獲得完整的序列。雖然這些新一代測序儀以及芯片的實際制作過程似乎都和傳統(tǒng)的測序方法有很大的不同，而且各有特點（表3），但實際上它們背后的原理和技術(shù)都是非常相似甚至是相同的（圖1b）。新一代測序法首先也是將基因組DNA隨機切割成小片段DNA分子，然后在體外給這些小片段分子的末端連接上接頭制成文庫，也可以使用配對標簽（mate-pairedtag）制成跨步文庫（jumpinglibraries）。隨后可以通過原位polony（insitupolony，小詞典1）、微乳液PCR（emulsionPCR）或橋式PCR（brid

16、gePCR）（圖5）等方法獲得測序模板。上述方法有一個共同點，那就是任何一個小片段DNA分子的PCR擴增產(chǎn)物都是在空間上聚集的：原位9 9一重要課題又再一次擺在了科研人員的面前。這一次，我們找到了一個非常簡單但是又很巧妙地方法。在高密度的反應芯片表面使用層流（laminarflow）加樣方式，反應試劑會通過擴散作用很好地進入每一個反應體系，而且也可以用層流的方式洗去多余的反應試劑。現(xiàn)在，所有的新一代測序儀都采用了這種層流加樣方法。為了將每個單獨的測序反應都分隔開來，我們一開始使用平板（芯片），不過在平板上平均每一平方厘米的面積上最多只能同時進行數(shù)百至數(shù)千個反應。但我們希望達到的是在每平方厘米的

17、面積上同時進行100萬個測序反應，這樣才能令測序儀小型化，同時節(jié)省試劑并進行快速成像和測序。為了實現(xiàn)更高密度的測序反應，我們在平板上制作了很多小孔，將每個反應體系都安置在這些小孔中，這些小孔都足夠深，足以分隔每個反應體系。雖然這種方法極大提高了測序反應的密度，縮小了平板的面積，但是要達到我們的要求還是需要60mm60mm大小的芯片才行。針對圖像采集問題使用了商業(yè)化的天文學照相（astrologicalgradecamera）器材，在電荷偶合裝置（CCD）的表面連接上光纖束（fiber-opticbundle）。這些光纖是錐形排列的，這樣可以將大范圍的光信號都傳輸?shù)紺CD表面上很小的一個范圍。采

18、取下面兩個步驟，我們就可以制成含有高密度小孔的芯片：先將光纖束連接到類似于載玻片一樣的一次性芯片上，然后用酸蝕刻（acidetchingprocedure）技術(shù)在玻片的另一面打上小孔。這種酸蝕刻技術(shù)是根據(jù)制作生物傳感器的技術(shù)改進而來的。454公司制作的每張芯片上可以達到數(shù)百萬個小孔，每一個小孔都是一個獨立的“反應站”，互不干擾，測序反應發(fā)出的光被連接在芯片上的光纖傳送到CCD記錄下來（圖4）。這種芯片就好像集成電路一樣一次可以同時處理數(shù)百萬個測序反應。這種芯片同樣也能被其它通過發(fā)光檢測技術(shù)的產(chǎn)品所使用。454測序儀也沒有像以前的96孔板焦磷酸測序儀那樣使用液態(tài)的試劑，而是將試劑和模板統(tǒng)統(tǒng)都吸附

19、在一個個微珠上，然后把這些微珠一個個地放到芯片上的小孔中，每孔一個微珠。這種固定步驟不僅保證了每孔測序反應的獨立性，也極大地節(jié)省了試劑消耗費用。圖4454測序儀技術(shù)應用簡介。（a）分離基因組DNA，隨即切割成小片段，每個片段兩端連接上接頭序列，并變性形成單鏈；（b）將（a）中制成的單鏈分子與微珠連接，每個微珠連接上一條單鏈分子，然后將這些微珠在乳液中包裹成一個個油包水的小液滴，每個液滴中包含一個微珠，然后進行乳液PCR擴增，最后每個微珠上都會攜帶有上千萬條待測模板分子；（c）打破液滴，收集微珠，然后將微珠放置到芯片上的小孔中，每個小孔中一個微珠；（d）在每個小孔中置入吸附有焦磷酸測序反應所需酶

20、的小微珠；（e）微珠置入前的芯片圖像；（f）454測序儀主要包括以下幾個部分：（i）液體試劑供應裝置；（ii）反應池；（iii）光線探測成像系統(tǒng)和計算機控制系統(tǒng)。abcdiiiiiief2121最后，需要考慮的當然是價格因素，各個新一代測序儀的費用都不相同，作為消費者，當然希望各個測序儀生產(chǎn)廠家之間的競爭更加激烈一點。單純比較每個堿基的測序費用是一個不錯的選擇方法，不過有時這也會誤導我們，比如準確率更高的方法當然費用會高一些。表11新一代測序技術(shù)的應用應用范圍應用舉例全基因組測序（Completegenomeresequencing）人類個體基因組多態(tài)性及突變的全面檢測約化表示測序法（Redu

21、cedrepresentationsequencing）大規(guī)模多態(tài)性檢測靶向再測序（Targetedgenomicresequencing）靶向多態(tài)性及突變檢測末端配對測序（Pairedendsequencing）遺傳及獲得性結(jié)構(gòu)變異檢測環(huán)境基因組測序（Metagenomicsequencing）傳染性及共生菌群檢測轉(zhuǎn)錄組測序（Metagenomicsequencing）定量基因表達及選擇性剪切；轉(zhuǎn)錄注釋；轉(zhuǎn)錄SNPs或體細胞突變檢測小RNA測序（SmallRNAsequencing）microRNA表達譜酸性亞硫酸鹽標記DNA測序（Sequencingofbisulfite-treatedDNA）基因組DNA中胞嘧啶甲基化模式的測定染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-Seq）全基因組蛋白質(zhì)與DNA相互作用圖譜核酶片段及測序（Nucleasefragmentationandsequencing）核小體定位分子條碼（Molecularbarcoding）多個體來源樣品的多通路測序5. 總結(jié)過去幾年間，新一代測序技術(shù)獲得了突飛猛進的進展，同時有好幾款使用大規(guī)模平行循環(huán)芯片測序技術(shù)的測序儀得到了廣泛的應用。這幾款測序儀雖然使用的技術(shù)有所差異，但是在測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和數(shù)量方面都有著同樣的特征，因此也都面臨著同樣的試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析和注釋的問題。不過，這些新