瓊脂糖凝膠電泳-完整整理版（優(yōu)選課資）

1、1聽(tīng)雨C書屋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)專題凝膠電泳技術(shù) 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳分子雜交技術(shù) Southern blot Northern blot質(zhì)粒提取、細(xì)菌總DNA提取2聽(tīng)雨C書屋電泳技術(shù)簡(jiǎn)介什么是電泳技術(shù)？ 電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。3聽(tīng)雨C書屋電泳技術(shù)的分類電泳法可分為自由電泳（無(wú)支持體）及區(qū)帶電泳（有支持體）兩大類。自由電泳包括 Tise-leas式微量電泳

2、、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。區(qū)帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、醋酸纖維薄膜電泳、非凝膠性支持體區(qū)帶電泳（支持體有：淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)、凝膠支持體區(qū)帶電泳凝膠支持體區(qū)帶電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等。4聽(tīng)雨C書屋凝膠電泳技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳5聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。其本身不帶有電荷。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離

3、、鑒定及純化。6聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)原理DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA ，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子。7聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖與瓊脂的區(qū)別瓊脂是由瓊脂糖（agarose）和瓊脂果膠（agaropectin）組成的。瓊脂糖的結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖；瓊脂果膠是由許多更小的分子組成的異質(zhì)

4、混合物。它們的結(jié)構(gòu)相似，但瓊脂果膠帶硫酸根和羧基組分，凝膠能力差。在瓊脂糖制備過(guò)程中需要把瓊脂果膠盡量去除，否則瓊脂糖有可能存在極微量硫酸根和丙酮酸取代電離基團(tuán)，就會(huì)造成電內(nèi)滲，電內(nèi)滲對(duì)質(zhì)點(diǎn)的移動(dòng)產(chǎn)生影響。質(zhì)量較好的瓊脂糖硫酸根含量比較低，通常在0.2%以下，電內(nèi)滲比較小，通常在0.13%以下。簡(jiǎn)言之，瓊脂糖是從瓊脂中精細(xì)提取的，有自身獨(dú)特的性質(zhì)，所以瓊脂糖要比瓊脂貴得多。8聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠電泳特點(diǎn)優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) 因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲 對(duì)蛋白質(zhì)吸附極微，故無(wú)拖尾現(xiàn)象。 凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來(lái)分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。 透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)

5、行染色。 不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測(cè)定 有熱可逆性缺缺 點(diǎn)點(diǎn) 機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。 易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制。 瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。 與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。 9聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠的配置1. 根據(jù)電泳需要，配置合適濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為 1 TAE或0.5TBE。注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。2. 根據(jù)制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉。 注意：總液體量不宜超過(guò)三角錐瓶的50%容量。3. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖注意：必須保證瓊

6、脂糖充分完全溶解，否則，會(huì)造成電泳圖像模糊不清。加熱時(shí)如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。10聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠的配置3. 使溶液冷卻至60左右，如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml，并充分混勻不提倡使用。注意：溴化乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴化乙錠的溶液時(shí)，請(qǐng)戴用手套。溴化乙錠在可見(jiàn)光下會(huì)分解。5. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在35 mm 之間。 注意：不要產(chǎn)生氣泡，溶液溫度太高(60)，會(huì)使得水分過(guò)分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。6. 在室溫下使膠凝固（大約30 分鐘），然后放置于電泳槽中進(jìn)

7、行電泳。注意： 凝膠不立即使用時(shí)，用保鮮膜將凝膠包好在4下保存，或者放在制膠的緩沖液中，一般可保存25 天。11聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠緩沖液有幾種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液（pH8.0,TAE，也稱為E緩沖液）Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE)Tris-磷酸鹽緩沖液(TPE)12聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠緩沖液13聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠緩沖液14聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠緩沖液TBE可以使用10次左右，而TAE用23次就要更換。電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA條帶模糊或不規(guī)則DNA帶遷移。電泳緩沖液剛好沒(méi)過(guò)凝膠1mm為好，太多則電流

8、加大，凝膠發(fā)熱。15聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液是上樣時(shí)與樣品一起加入泳道的。載樣緩沖液有三個(gè)作用：增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；使樣品帶有顏色便于上樣操作；其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。上樣緩沖液有幾種，但基本都包括溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF。16聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠載樣緩沖液溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無(wú)關(guān)；在0.5TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍(lán)的速率約與長(zhǎng)約300bp的線性雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長(zhǎng)4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中基本不會(huì)變化。17聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠載

9、樣緩沖液18聽(tīng)雨C書屋影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在719聽(tīng)雨C書屋影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子越大，摩擦阻力越大，同時(shí)大分子通過(guò)凝膠孔徑的效率也低于較小的分子，所以分子大的遷移慢。等量的空間結(jié)構(gòu)，緊密的電泳快（超螺旋線性DNA）一般來(lái)說(shuō)，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。20聽(tīng)雨C書屋影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1

10、凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7簡(jiǎn)言之，濃度越大，分子孔徑就越小，DNA遷移速率就越低，反之遷移速率就大。另外，濃度也跟凝膠的分辨率有關(guān)，濃度越大，分辨率越高，但分離的片段就越小。21聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠的濃度22聽(tīng)雨C書屋影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開(kāi)環(huán)。23聽(tīng)雨C書屋影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7 低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率

11、與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過(guò)5-8V/cm24聽(tīng)雨C書屋影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7 包括標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖以及正在研制的介于二者之間的瓊脂糖。其分辨率等各有不同。25聽(tīng)雨C書屋瓊脂糖凝膠的濃度26聽(tīng)雨C書屋影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7溶液pH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大，尤其對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性分子，緩沖液pH還會(huì)影響到其電泳方向;溶液的離子強(qiáng)度過(guò)低，會(huì)使

12、電導(dǎo)率降低，DNA不是全然不動(dòng)就是遷移極慢；而離子過(guò)強(qiáng)時(shí)，電導(dǎo)率上升，會(huì)產(chǎn)生大量熱能，使凝膠變化甚至熔化，也會(huì)使DNA變性。27聽(tīng)雨C書屋影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7染色劑溴化乙錠插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長(zhǎng)度增加，因此，線性DNA-染料復(fù)合物在凝膠中的遷移率約降低15%。28聽(tīng)雨C書屋DNADNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析問(wèn)題問(wèn)題原因原因解決辦法解決辦法DNADNA帶模糊帶模糊1) DNA降解避免核酸酶污染2) 電泳緩沖液陳舊電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖能力減弱

13、，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液3) 所用電泳條件不合適電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm，溫度30；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)15；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力4) DNA上樣量過(guò)多減少凝膠中DNA上樣量5) DNA樣含鹽過(guò)高電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽6) 有蛋白污染電泳前酚抽提去除蛋白7) DNA變性電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA29聽(tīng)雨C書屋DNADNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析問(wèn)題問(wèn)題原因原因解決辦法解決辦法不規(guī)則不規(guī)則DNA帶遷移帶遷移1) 對(duì)于/Hind III片段cos位點(diǎn)復(fù)性電泳前于65加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘2) 電泳條件不合適電泳電壓不超過(guò)20V/cm；溫度30；經(jīng)常更換電泳緩沖液3) DNA變性以20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱帶弱或無(wú)帶弱或無(wú)DNA帶帶1) DNA的上樣量不夠增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低2) DNA降解避免DNA的核酸酶污染3) DNA走出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度4) 對(duì)于EB染色的DNA，所用光源不合適應(yīng)用短波