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文檔簡介

1、會計學(xué)1Westernblot技術(shù)詳細技術(shù)詳細第1頁/共27頁快速、特異，信號弱、昂貴快速、特異，信號弱、昂貴信號強、二抗選擇多，非特異性結(jié)合信號強、二抗選擇多，非特異性結(jié)合第2頁/共27頁l轉(zhuǎn)膜l封閉l一抗雜交l二抗雜交l底物顯色n蛋白樣品的制備第3頁/共27頁第4頁/共27頁第5頁/共27頁第6頁/共27頁第7頁/共27頁第8頁/共27頁第9頁/共27頁第10頁/共27頁第11頁/共27頁大于大于20KD0.45 um20KD0.2 um7KD0.1 um第12頁/共27頁轉(zhuǎn)膜第13頁/共27頁濕轉(zhuǎn)第14頁/共27頁半干轉(zhuǎn)第15頁/共27頁第16頁/共27頁一抗、二抗孵育第17頁/共27頁

2、辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)DAB 第18頁/共27頁第19頁/共27頁第20頁/共27頁第21頁/共27頁？ 第22頁/共27頁背景太高膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染封閉不充分封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)交叉反應(yīng)抗體濃度過高抗體濃度過高 原原因因?qū)Σ卟咿D(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜前用100%甲醇將甲醇將膜完全浸濕膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液沖液檢測一抗、二抗與封閉檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測一抗、二抗雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度的工作濃度第23頁/共27頁沒有陽性條帶或比較弱抗體染色不充分抗體染色不充分靶蛋白含量太低靶蛋白含量太低HRP抑制劑抑制劑轉(zhuǎn)膜時間不夠轉(zhuǎn)膜時間不夠曝光時間過短曝光時間過短 原原因因?qū)Σ卟咴黾涌贵w滴度，延長孵增加抗體滴度，延長孵育時間育時間增加樣本上樣量增加樣本上樣量所用溶液和容器中避免所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉含有疊氮化鈉大分量蛋白相應(yīng)增加轉(zhuǎn)大分量蛋白相應(yīng)增加轉(zhuǎn)膜時間及曝光時間膜時間及曝光時間第24頁/共27頁彌散性條帶或非特異性條帶抗體濃度太高抗體濃度太高蛋白上樣量太多蛋白上樣量太多交叉反應(yīng)交叉反應(yīng) 原原因因?qū)Σ?/p>

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