高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞卵巢組織的差異mRNAs篩選分析.doc

1、高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞卵巢組織的差異mRNAs篩選分析p 打開文本圖片集【摘要】：p 環(huán)境熱應激是制約我國南方地區(qū)集約化家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素，持續(xù)高溫使蛋雞出現(xiàn)產(chǎn)蛋率和蛋品質下降等問題，高溫熱應激是蛋雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展不能忽視的重要問題。該試驗研究常溫對照組和高溫熱應激組成年蛋雞卵巢組織的差異mRNAs表達譜。60只26周齡成年蛋雞隨機分為常溫對照組和高溫熱應激組，30 d后2組分別隨機選用3只共6只采集卵巢組織制備HE染色組織切片并利用深度測序技術分析p mRNAs差異表達譜。相比對照組，高溫組組織切片中卵泡的內容物增多，著色加深，卵泡壁增厚。測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析p 發(fā)現(xiàn)，熱應激處理后相比常溫對照組

2、有146個mRNAs表達水平差異顯著（P97（批號：BW20_10A）。1.2 儀器和試劑低溫高速離心機（Sigma）、普通離心機（Sigma）、電子分析p 天平（Shimadzu）、電熱鼓風干燥箱（廣州吉迪）、I_53型倒置顯微鏡（Olympus）、切片機（Leica）、電動研磨棒（TianGen）。多聚甲醛、乙醇、異丙醇、氯仿等試劑均為國產(chǎn)分析p 純產(chǎn)品。1.3 試驗動物分組與樣品采集挑選產(chǎn)蛋率、體重相近的26周齡蛋雞60只，隨機分為2組，對照組（CK）和熱應激組（HC）各30只，采用三層階梯式籠養(yǎng)，每籠2只?？刂瞥貙φ战M溫度為（25±1），濕度6575;高溫組每天10：001

3、6：00控制溫度為（32±1），其余時間溫度與常溫對照組相同。對照組和高溫組飼喂實驗室通用基礎日糧6，定時投料，自由采食和飲水，每天18：00清糞，光照時間為16 h/d，光照強度為1015 l_，定期免疫。連續(xù)飼養(yǎng)30 d，每天18：30收集當天產(chǎn)雞蛋，分別計算2組蛋雞的平均產(chǎn)蛋率，30 d后2組分別隨機選用蛋雞3只，共6只，取卵巢組織于2 mL RNase-free離心管中置-80 保存?zhèn)溆谩?.4 組織切片HE染色取樣品切成大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小組織塊放于4PFA（多聚甲醛）固定液中固定（固定液的體積為組織塊的1520倍），固定

4、24 h;再經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（5 m）、展片、烘干、水洗、HE染色，最后用中性樹膠封片，貼上標簽并編號，顯微鏡下觀察并拍照。1.5 樣品測序及數(shù)據(jù)分析p 樣品送杭州聯(lián)川生物有限公司測序分析p ，采用去除rRNA的建庫方式進行測序分析p ，檢測各樣品中不同mRNAs的表達水平。首先利用Cutadapt7軟件剔除測序數(shù)據(jù)中的測序載體、低質量和不能識別的堿基信號等干擾信息，獲得可進一步分析p 的高質量原始測序數(shù)據(jù)。再用Bowtie28和Hat29將測序數(shù)據(jù)與雞的基因組序列信息比對后裝配出樣品的轉錄組序列信息數(shù)據(jù)，最后利用StringTie10和Ballgown11軟件計算所有mRNAs

5、的表達水平。差異mRNAs表達的數(shù)據(jù)篩選，首先利用StringTie10軟件計算各mRNAs的FPKM值，再利用R軟件包Ballgown11篩選差異mRNAs，篩選條件為log2（fold change）>1或者log2（fold change）<-1并且統(tǒng)計學差異顯著（P<0.05）。2 結果與分析p 2.1 高溫飼養(yǎng)條件對蛋雞產(chǎn)蛋率和卵巢組織結構的影響連續(xù)飼養(yǎng)30 d，每天收集當天產(chǎn)雞蛋，分別計算2組蛋雞的平均產(chǎn)蛋率，對照組平均產(chǎn)蛋率為88.91，高溫組平均產(chǎn)蛋率為81.34，2組數(shù)據(jù)比較差異顯著（P<0.05），高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞產(chǎn)蛋率顯著下降。采集對照組和高溫組

6、蛋雞卵巢組織，制備石蠟切片進行HE染色后光學顯微鏡觀察。在對照組卵巢切片中，卵泡內容物著色淺（圖1A）;而在高溫組卵巢切片中，卵泡內容物著色點增多、著色加深，卵泡壁增厚明顯，同樣處理程序制備的切片中高溫組的中小卵泡多呈不規(guī)則環(huán)形（圖1B）。高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞卵巢中卵泡組織結構出現(xiàn)異常。2.2 mRNAs差異表達譜分析p 由mRNAs在2組樣品中的差異表達分析p 可知，在高溫應激組中表達差異顯著（P<0.05）的基因數(shù)目分別是77個上調表達、69個下調表達。對差異表達的mRNAs表達量分析p ，上調和下調的前20個基因如表1、2所示。2.3 差異表達mRNAs基因功能注釋與分析p 對差異表

7、達mRNAs進行功能注釋分析p 發(fā)現(xiàn)，在GO數(shù)據(jù)庫中可以極顯著（P<0.01）富集的功能群，分子功能群（molecular_function，MF）有8個，生物學過程群（biological_process，BP）有16個，細胞組分群（cellular_ponent，CC）有4個，相關的差異表達mRNAs有63個（表3）。在KEGG數(shù)據(jù)庫中可以富集（P<0.05）的通路（表4）有維生素B6代謝、卵母細胞減數(shù)分裂、檸檬酸代謝（三羧酸循環(huán)）和細胞周期（編號分別是ko00750、ko04114、ko00020和ko04110），相關的差異表達mRNAs有11個。3 討論3.1 高溫飼養(yǎng)條

8、件影響蛋雞的產(chǎn)蛋率和卵巢組織結構全球變暖是一種主要的壓力環(huán)境狀況，體溫升高到生理恒溫點以上（熱應激），從而影響動物的繁殖效率，熱應激對生殖功能的損傷涉及受精過程以及胚胎到胎兒發(fā)育的早晚期等階段，這種情況對牲畜造成了巨大的經(jīng)濟損失12。試驗中可見高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞產(chǎn)蛋率顯著下降。由于家禽具有羽毛豐厚、皮膚無汗腺、代謝旺盛、體溫高等特點，其生產(chǎn)性能極易受到環(huán)境溫度的影響，高溫一直是影響家禽養(yǎng)殖的一個重要因素13。在高溫組卵巢切片中可見卵泡內容物著色點增多，著色加深，卵泡壁增厚明顯，同樣處理程序制備的切片中高溫組的中小卵泡多呈不規(guī)則環(huán)形。高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞卵巢中卵泡組織結構出現(xiàn)異常，可見在高溫應激組

9、中，原始卵泡的比例下降，這提示在熱應激條件下飼養(yǎng)蛋雞，影響卵巢功能，抑制卵泡發(fā)育。熱應激影響蛋雞的生長速度、產(chǎn)蛋量和生育力，環(huán)境溫度過高是影響熱帶和亞熱帶國家家禽生產(chǎn)經(jīng)濟和生物效率的一個嚴重問題，隨著全球氣候變化，這一問題預計將變得更加突出，這些負面影響造成了巨大的經(jīng)濟損失14。3.2 高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞卵巢組織差異mRNAs的通路分析p 差異mRNAs在KEGG數(shù)據(jù)庫中可以富集（P<0.05）的通路有維生素B6代謝、卵母細胞減數(shù)分裂、檸檬酸代謝（三羧酸循環(huán)）和細胞周期。以上4個通路與卵子發(fā)生、卵泡發(fā)育均有密切關系。減數(shù)分裂過程需要與周期蛋白依賴激酶（CDKs）相關的特定周期蛋白參與，以

10、確保DNA復制的保真度，不同細胞周期蛋白在減數(shù)分裂中具有不同的特異性調控15。在卵母細胞減數(shù)分裂周期的不同階段，有幾種直接或間接誘導凋亡的分子16。熱應激破壞牛卵母細胞的縫隙連接和卵丘功能，卵丘細胞與卵母細胞之間以及卵母細胞之間的密切聯(lián)系對卵母細胞減數(shù)分裂的停止和恢復起著重要的調節(jié)作用，熱應激影響卵丘細胞通訊和功能，進而影響卵母細胞減數(shù)分裂的進程17。卵母細胞與顆粒細胞之間的細胞間通訊對正常卵泡分化和卵母細胞發(fā)育至關重要，卵母細胞調節(jié)顆粒細胞內糖酵解和TCA循環(huán)的方式與顆粒細胞的數(shù)量和卵母細胞的生長發(fā)育階段有關，卵母細胞通過調節(jié)編碼糖酵解酶的基因表達水平來控制顆粒細胞的糖酵解，卵丘細胞與卵母細

11、胞之間的代謝協(xié)同性是顆粒細胞產(chǎn)生能量、卵母細胞與卵泡發(fā)育所必需的18。研究表明能量分子通過線粒體代謝產(chǎn)生足夠的ATP與卵母細胞質量之間存在聯(lián)系，其中脂肪酸一旦進入線粒體基質就被分解成乙酰輔酶a分子，乙酰輔酶a分子通過TCA循環(huán)和電子傳遞鏈進一步代謝產(chǎn)生ATP19。母體B族維生素水平可影響生育和妊娠的建立，并可以直接影響卵泡和卵母細胞的發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn)在卵泡刺激素（FSH）作用下限制成年母羊日糧中維生素B12的供應影響卵泡的發(fā)育20。吡啶是維生素B6的催化活性形式，在多種細胞過程中起著至關重要的作用，吡哆醇提高了囊胚率和孵化率，體外受精過程中，吡哆醇通過增加胚胎總細胞數(shù)、降低CTSB mRNA表達

12、和凋亡率，也顯著提高了胚胎的質量，可見體外受精過程中添加吡啶是提高牛卵母細胞發(fā)育能力和胚胎質量的有效手段21。可見，熱應激有多種可能的作用機制，通過影響以上4種通路進而造成蛋雞卵巢損傷、降低產(chǎn)蛋率。4 結論熱應激造成蛋雞卵巢損傷，常溫組和高溫組蛋雞卵巢組織mRNAs表達譜組間差異表達的共有146個，差異mRNAs基因功能分析p 與熱應激過程密切相關的調控通路有維生素B6代謝、卵母細胞減數(shù)分裂、檸檬酸代謝（三羧酸循環(huán)）和細胞周期共4個。該研究篩選的一批候選基因為進一步解析蛋雞卵巢熱應激的損傷機制提供了重要參考?！緟⒖嘉墨I】：p 1 季建華，鄧玲玲.20_年一季度我國蛋雞市場分析p 及后市預測J.

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