蛋白質(zhì)印跡法westernblot應(yīng)用介紹

1、會(huì)計(jì)學(xué)1蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法westernblot應(yīng)用介紹應(yīng)用介紹 蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認(rèn)為是美國(guó)斯坦福大學(xué)的喬治斯塔克（George Stark）。在尼爾伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的分析生物化學(xué)（Analytical Biochemistry）中首次被稱為Western Blot。 蛋白免疫印跡( Western Blot) 是將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)己廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等多個(gè)方面。分多次將細(xì)胞收至一個(gè)管中（2

2、 2）蛋白含量測(cè)定（福林）蛋白含量測(cè)定（福林- -酚法酚法 ） 目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）、Lowry法（福林-酚試劑法）、 BCA法等。 1、配制BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液：0、25、50、100、150、200、300 g/mL（用PBS配制）。 樣品液：取原液2 L至200 L （用PBS配制）。 2、操作：先取一塊新的96孔板，于630nm下測(cè)光密度值，取溶液/樣品40L和E液40L，每個(gè)濃度點(diǎn)均作三復(fù)孔，振蕩混勻。37C反應(yīng)10 min后，加入福林酚試劑（1:15稀釋）160L，振蕩混勻，37C反應(yīng)30 min。630 nm下測(cè)光密度值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度對(duì)

3、光密度值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品蛋白濃度。凝膠濃度（）最佳分離范圍（KD)650-150830-901020-801212-601510-401、配制下層膠（分離膠）靜置1h后制上層膠（濃縮膠）2、配制上層膠（濃縮膠）加完后插上梳子，靜置1h(1) SDS-PAGE凝膠配制 操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。加完分離膠后膠，加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。分離膠充分凝固就倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。制膠過程注意事項(xiàng)：制膠過程注意事項(xiàng)：(2) (2) 上樣與電泳上

4、樣與電泳 將制備好的樣品溶解后，把蛋白樣品直接上樣到將制備好的樣品溶解后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGESDS-PAGE膠加樣孔膠加樣孔內(nèi)即可。跑上層膠，內(nèi)即可。跑上層膠，70V 35Ma/70V 35Ma/塊塊 45 min45 min；跑下層膠，；跑下層膠，100V 35Ma/100V 35Ma/塊塊膠膠 1 h1 h左右。左右。半干轉(zhuǎn)移法半干轉(zhuǎn)移法 將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣夾在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙間。將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣夾在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙間。 | |紙紙| |膠膠| |膜膜| |紙紙| |槽式濕轉(zhuǎn)法槽式濕轉(zhuǎn)法 將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中。將凝膠

5、和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中。 | |海綿海綿| |紙紙| |膠膠| |膜膜| |紙紙| |海綿海綿| |轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)濾紙、膠、膜之間濾紙、膠、膜之間不能有氣泡不能有氣泡。濾紙、膠、膜的濾紙、膠、膜的大小大小和和擺放順序擺放順序。膠和膜上要做好膠和膜上要做好標(biāo)記標(biāo)記，識(shí)別正反面和上下，識(shí)別正反面和上下 。PVDFPVDF膜需要膜需要100%100%甲醇預(yù)處理，后續(xù)操作中膜必須保持濕潤(rùn)。甲醇預(yù)處理，后續(xù)操作中膜必須保持濕潤(rùn)。轉(zhuǎn)膜條件：轉(zhuǎn)膜條件：推薦：推薦：100V 100V ，1212小時(shí)；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。小時(shí)；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的不同而不

6、同。 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過程。 將轉(zhuǎn)印膜浸泡到封閉液中，將膜上沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的區(qū)域結(jié)合將轉(zhuǎn)印膜浸泡到封閉液中，將膜上沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的區(qū)域結(jié)合上蛋白質(zhì)，目的是上蛋白質(zhì)，目的是使抗體與特異的蛋白質(zhì)結(jié)合。使抗體與特異的蛋白質(zhì)結(jié)合。 封閉液封閉液l 5 % 5 % TBSTTBST脫脂奶粉溶液（脫脂奶粉溶液（30ml30ml）l 牛血清白蛋白溶液牛血清白蛋白溶液( BSA )( BSA ) 搖床上緩慢搖動(dòng)封閉，室溫?fù)u床上緩慢搖動(dòng)封閉，室溫2 h2 h或或4 4過夜。過夜。 把把NCNC膜放在密閉塑料

7、袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的一抗，室溫或膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的一抗，室溫或4 4在側(cè)擺在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以4 4緩慢搖動(dòng)孵緩慢搖動(dòng)孵育過夜?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。育過夜?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。 回收一抗。加入回收一抗。加入TBSTTBST液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-105-10分鐘。吸盡洗滌液分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌后，再加入洗滌液洗滌5-105-10分鐘。共洗滌分鐘。共洗滌3 3次。如果結(jié)

8、果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。 注：注：WesternWestern結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照，通?？梢赃x用結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照，通?？梢赃x用TubulinTubulin抗體抗體或或ActinActin抗體抗體，進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)。，進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)。 NCNC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的熒光二抗，膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的熒光二抗， 3737 緩緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgGIgG，則二

9、抗需選擇抗小鼠，則二抗需選擇抗小鼠IgGIgG的二抗。的二抗。 回收二抗。加入回收二抗。加入TBSTTBST液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-105-10分鐘。吸盡洗分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌滌液后，再加入洗滌液洗滌5-105-10分鐘。共洗滌分鐘。共洗滌3 3次。如果結(jié)果背景較高可以次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。 DABDAB顯色法顯色法 ECLECL顯色原理顯色原理：( (二抗用二抗用HRPHRP標(biāo)標(biāo)記記) )反應(yīng)物為過氧化物反應(yīng)物為過氧化物+ +魯米諾，魯米諾，如果遇到如果遇到HRPHRP即發(fā)光

10、，可使膠片曝即發(fā)光，可使膠片曝光顯影。光顯影?；瘜W(xué)發(fā)光顯色法化學(xué)發(fā)光顯色法(ECL ECL )uECLECL化學(xué)發(fā)光顯色化學(xué)發(fā)光顯色 比較常用，結(jié)果容易控制，但是被催化是比較常用，結(jié)果容易控制，但是被催化是 靈敏度差一點(diǎn)靈敏度差一點(diǎn)uDABDAB顯色顯色 比較靈敏，是比較靈敏，是HRPHRP最敏感的底物最敏感的底物影響抗原抗體反應(yīng)的因素影響抗原抗體反應(yīng)的因素背景太高背景太高抗體濃度過高抗體濃度過高封閉不充分封閉不充分膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染抗體與封閉劑出現(xiàn)抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)交叉反應(yīng) 雜交前檢測(cè)一抗、二抗的雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度工作濃度延長(zhǎng)封閉時(shí)

11、間或更換封閉延長(zhǎng)封閉時(shí)間或更換封閉液液轉(zhuǎn)膜前用甲醇將膜完全浸轉(zhuǎn)膜前用甲醇將膜完全浸濕濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)是否有交叉反應(yīng)非特異條帶多非特異條帶多抗體濃度過高抗體濃度過高膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染封閉不充分封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)交叉反應(yīng) 雜交前檢測(cè)一抗、二抗雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度的工作濃度轉(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜前用100%100%甲醇將膜甲醇將膜完全浸濕完全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新

12、鮮轉(zhuǎn)膜緩手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)劑是否有交叉反應(yīng)蛋白帶型條狀蛋白帶型條狀上樣過量上樣過量樣品沉淀樣品沉淀樣品中的污染樣品中的污染制膠不佳制膠不佳 降低上樣量降低上樣量加大樣品中的加大樣品中的SDSSDS濃度濃度離心樣品離心樣品確保灌膠均勻確保灌膠均勻 條帶模糊條帶模糊 蛋白樣品部分變性蛋白樣品部分變性蛋白樣品部分還原蛋白樣品部分還原電泳時(shí)間過長(zhǎng)電泳時(shí)間過長(zhǎng) 完全變性蛋白完全變性蛋白確保加入足夠的確保加入足夠的DTTDTT或或-巰基乙醇巰基乙醇觀察指示劑染料，掌握觀察指示劑染料，掌握恰當(dāng)?shù)碾娪緯r(shí)間恰當(dāng)?shù)碾娪緯r(shí)間啞鈴型條帶或啞鈴型條帶或

13、“微笑微笑” 條帶條帶上樣體積過大導(dǎo)致不完上樣體積過大導(dǎo)致不完全堆積全堆積電泳過程中電場(chǎng)不均勻電泳過程中電場(chǎng)不均勻分離膠表面不齊分離膠表面不齊 使用恰當(dāng)上樣體積使用恰當(dāng)上樣體積如果蛋白濃度已知，如果蛋白濃度已知，上樣時(shí)確保對(duì)稱上樣時(shí)確保對(duì)稱制膠時(shí)使分離膠表面制膠時(shí)使分離膠表面水平水平無條帶的原因無條帶的原因 蛋白樣品制備蛋白樣品制備 檢查膠：考馬斯亮藍(lán)染膠檢查膠：考馬斯亮藍(lán)染膠 檢查膜：麗春紅檢查膜：麗春紅S S染色染色 抗體滴度太低抗體滴度太低 顯色顯色 試劑放置太久或存放條件不正確試劑放置太久或存放條件不正確分多次將細(xì)胞收至一個(gè)管中 DABDAB顯色法顯色法 ECLECL顯色原理顯色原理：( (二抗用二抗用HRPHRP標(biāo)標(biāo)記記) )反應(yīng)物為過氧化物反應(yīng)物為過氧化物+ +魯米諾，魯米諾，如果遇到如果遇到HRPHRP即發(fā)光，可使膠片曝即發(fā)光，可使膠片曝光顯影。光顯影。化學(xué)發(fā)光顯色法化學(xué)發(fā)光顯色法(ECL ECL )影響抗原抗體反應(yīng)的因素影響抗原抗體反應(yīng)的因素背景太高背景太高抗體濃度過高抗體濃度過高封閉不充分封閉不充分