蛋白質(zhì)的分離純化剖析

1、會計學1蛋白質(zhì)的分離純化剖析蛋白質(zhì)的分離純化剖析 主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。蛋白質(zhì)，但分辨率低。1 1、粗分級分離、粗分級分離l 不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不化

2、層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 450%50%飽和度飽和度100%100%飽和飽和析出析出析出析出分段鹽析分段鹽析第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質(zhì)的層析分離蛋白質(zhì)的層析分離n應用廣泛。特征：有一個固定相和一個流動相應用廣泛。特征：有一個固定相和一個流動相。由于待分離的各種物質(zhì)在這兩個相分配系數(shù)。由于待分離的各種物質(zhì)在這兩個相分配系數(shù)不同，當兩個相作相對運動時，這些物質(zhì)在兩不同，當兩個相作相對運動時，這

3、些物質(zhì)在兩相間反復多次分配，結(jié)果使其相互分開。相間反復多次分配，結(jié)果使其相互分開。n根據(jù)兩相的狀態(tài)，層析法可分為：氣相層析和根據(jù)兩相的狀態(tài)，層析法可分為：氣相層析和液相層析；按層析原理可分為：吸附層析、分液相層析；按層析原理可分為：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析等。按操作形式分為：柱層析、薄層層析層析等。按操作形式分為：柱層析、薄層層析、紙層析等。、紙層析等。n 分配系數(shù)分配系數(shù): k=C: k=Cs s/C/Cm m , ,物質(zhì)在固定相與流動相濃度之物質(zhì)在固定相與流動相濃度之比。質(zhì)量分配系數(shù)：比。質(zhì)量分配系數(shù)：D=kD=kVs

4、 / Vm , Vs , Vm 為固定為固定相和流動相的體積。相和流動相的體積。一、層析的一般原理一、層析的一般原理 3216168816812412412228 如果柱頂加入如果柱頂加入32mg32mg樣品，樣品的質(zhì)量分樣品，樣品的質(zhì)量分配系數(shù)配系數(shù)D D為為1 1，即樣品在兩相中是等量分配。，即樣品在兩相中是等量分配。經(jīng)過經(jīng)過5 5層的平衡分配后，樣品在柱的分配情況層的平衡分配后，樣品在柱的分配情況見圖。樣品集中在中間。如果見圖。樣品集中在中間。如果D1D1D1，樣品集中在中間偏，樣品集中在中間偏下。下。 離子交換層析離子交換層析( (IEX)IEX)是根據(jù)電荷來分離分子的。是根據(jù)電荷來分

5、離分子的。 離子交換劑是通過化學反應將解離基團引入到惰性支持物上形成的。分為：離子交換劑是通過化學反應將解離基團引入到惰性支持物上形成的。分為： 陽離子交換劑陽離子交換劑: 解離基團帶負電解離基團帶負電, 結(jié)合陽離子結(jié)合陽離子; 陰離子交換劑陰離子交換劑: 解離基團帶正電解離基團帶正電, 結(jié)合陰離。結(jié)合陰離。 蛋白質(zhì)分子是兩性物質(zhì)。當?shù)鞍踪|(zhì)分子是兩性物質(zhì)。當pHpHpIpI，分子帶負電，可結(jié)合陰離子交換劑；當分子帶負電，可結(jié)合陰離子交換劑；當pHpIpHpI，分子帶正電，可結(jié)合陽離子交換劑。如陽離子交換劑與帶正電蛋白質(zhì)分子，分子帶正電，可結(jié)合陽離子交換劑。如陽離子交換劑與帶正電蛋白質(zhì)分子之間有

6、如下平衡：之間有如下平衡： 二、離子交換層析二、離子交換層析（一）基本原理（一）基本原理 帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合是可逆的。帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合是可逆的。 由于由于pHpH可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和帶電量，鹽離子會影響可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和帶電量，鹽離子會影響蛋白質(zhì)在交換劑上吸附。所以用蛋白質(zhì)在交換劑上吸附。所以用一定濃度的鹽溶液或一一定濃度的鹽溶液或一定定pH 的緩沖液的緩沖液就可把蛋白質(zhì)就可把蛋白質(zhì)從離子交換劑上從離子交換劑上洗脫下來洗脫下來。對多組分混合物，每種分子所帶的電荷不同，因此，。對多組分混合物，每種分子所帶的電荷不同，因此，可用不同的離子強度可用不同的離子強度 或不

7、同的或不同的pHpH溶液將蛋白質(zhì)從交換溶液將蛋白質(zhì)從交換劑上一一劑上一一洗脫下來。洗脫下來。 （二）離子交換劑的基本類型（二）離子交換劑的基本類型 根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì)，離子交換劑可被分為根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì)，離子交換劑可被分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。若按酸堿性的強弱，又陽離子交換劑和陰離子交換劑。若按酸堿性的強弱，又可分為強酸、強堿、弱酸、弱堿幾種類型的離子交換劑可分為強酸、強堿、弱酸、弱堿幾種類型的離子交換劑。 強酸和強堿型交換劑能在較廣泛的強酸和強堿型交換劑能在較廣泛的pH范圍內(nèi)（范圍內(nèi)（pH212）完全解離。弱酸型交換劑在低于完全解離。弱酸型交換劑在低于pH4、弱堿、弱堿型

8、交換劑在高于型交換劑在高于pH9就難于解離，因而失去交換能力。就難于解離，因而失去交換能力。因為一般蛋白質(zhì)在因為一般蛋白質(zhì)在pH68之間穩(wěn)定，所以常用弱酸或之間穩(wěn)定，所以常用弱酸或弱堿型交換劑。弱堿型交換劑。離子交換基團的結(jié)構和性質(zhì)離子交換基團的結(jié)構和性質(zhì)類型類型名稱名稱結(jié)構式結(jié)構式性質(zhì)性質(zhì)DEAE二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2弱堿性弱堿性QAE季胺乙基季胺乙基(quaternary aminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3強堿性強堿性Q季胺季胺(quaternary amine)-CH2-N

9、+-(CH3)3 強堿性強堿性CM羧甲基羧甲基(carboxymehyl)-O-CH2-COO -弱酸性弱酸性SE磺乙基磺乙基(sulfoethyl)-O-CH2CH2-SO3-強酸性強酸性SP磺丙基磺丙基(sulfopropyl)-O-CH2-CH2-CH2-SO3-強酸性強酸性P磷酸基磷酸基(phosphate)-O-PO3-中酸性中酸性S磺酸基磺酸基(sulfonate)-CH2-SO3-強酸性強酸性 可用來作為交換劑支持物的物質(zhì)種類較多。早期用于分離氨基酸、小肽和其它可用來作為交換劑支持物的物質(zhì)種類較多。早期用于分離氨基酸、小肽和其它小分子物質(zhì)的離子交換樹脂的支持物是小分子物質(zhì)的離子交

10、換樹脂的支持物是聚苯乙烯類聚苯乙烯類。 分離蛋白質(zhì)的常用的親水性支持物。有三大類：纖維素、葡聚糖凝膠分離蛋白質(zhì)的常用的親水性支持物。有三大類：纖維素、葡聚糖凝膠(sephadex)、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠(sepharose)和合成凝膠和合成凝膠(Trisacryl和和Fractogel)。1、離子交換纖維素、離子交換纖維素 離子交換纖維素是以纖維素做支持介質(zhì)的。具有松散的親水性網(wǎng)絡，較大的表離子交換纖維素是以纖維素做支持介質(zhì)的。具有松散的親水性網(wǎng)絡，較大的表面積，吸附容量大，通透性好。根據(jù)離子交換纖維素所含離子交換基團的性質(zhì)可分面積，吸附容量大，通透性好。根據(jù)離子交換纖維素所含離子交換基團的性

11、質(zhì)可分為強酸、強堿型和弱酸、弱堿型?，F(xiàn)將常用的離子交換纖維素列于下表中。為強酸、強堿型和弱酸、弱堿型?，F(xiàn)將常用的離子交換纖維素列于下表中。常用的離子交換纖維素常用的離子交換纖維素離子類型 解 離 基 團特 點DEAE-OCH2CH2N+(C2H5) 在 pH8.6 應用 陰離子陰離子解離基團解離基團交換交換摩爾摩爾(m mol/g) 特點特點DEAEOCH2CH2N(C2H5)0.11.1 在在pH4應用應用POPO3H20.77.4酸性較強酸性較強SEOCH2CH2SO3H0.20.3強酸性強酸性 在在Sephadex上接上某種離子交換基團。這種上接上某種離子交換基團。這種凝膠既有離子交換劑

12、的性質(zhì)，又有分子篩效應凝膠既有離子交換劑的性質(zhì)，又有分子篩效應。因此，其分離能力比單純的層析凝膠或離子。因此，其分離能力比單純的層析凝膠或離子交換劑好。葡聚糖凝膠離子交換劑的交換量比交換劑好。葡聚糖凝膠離子交換劑的交換量比相應的纖維素離子交換劑大，如相應的纖維素離子交換劑大，如DEAESephadex的交換量大約是的交換量大約是DEAE纖維素的纖維素的3.55.0倍。倍。2、離子交換葡聚糖凝膠（、離子交換葡聚糖凝膠（Sephadex）葡聚糖凝膠離子交換劑的性質(zhì)葡聚糖凝膠離子交換劑的性質(zhì) 類別類別離子交換基團離子交換基團床體床體積積ml/g分離范圍分離范圍(Mr)交換量交換量總交換容量總交換容量

13、(m mol/g) 強陽離子交強陽離子交換劑換劑SESephadex C25 C50-CH2CH2SO3H5932383104- 21053104-21052.02-52.02-5 SPSephadex C25 C50-CH2CH2CH2SO3H 2.30.3 弱陽離子交弱陽離子交換劑換劑CMSephadex C25 C50-O-CH2COOH61032403104-21053104-2105 4.50.5 強陰離子交換劑強陰離子交換劑QAESephadex A25 A505830403104-21053104-2105 3.04.0 弱陰離子交換劑弱陰離子交換劑DEAESephadex A2

14、5 A50-C2H4N+(C2H5)2H592583 3104-21053104-21053.54.5 類別類別離子交換基團離子交換基團床體積床體積ml/g分離范圍分離范圍(Mr)交換量交換量總交換容量總交換容量(m mol/g) -O-C2H4N+(C2H5)2 將各種離子基團引入到交聯(lián)瓊脂糖將各種離子基團引入到交聯(lián)瓊脂糖(Speharose CL)和大孔合成凝膠和大孔合成凝膠(Trisacryl或或Fractogel)上，則上，則形成一系列離子交換劑。這類交換劑即堅硬、吸附形成一系列離子交換劑。這類交換劑即堅硬、吸附容量大，形狀球形，能維持較好的流速及分辨率。容量大，形狀球形，能維持較好的

15、流速及分辨率。3、交聯(lián)凝膠離子交換劑、交聯(lián)凝膠離子交換劑（三）層析條件的選擇（三）層析條件的選擇1、離子交換劑的選擇、離子交換劑的選擇 選擇離子交換劑之前要了解樣品的性質(zhì)：熱穩(wěn)選擇離子交換劑之前要了解樣品的性質(zhì)：熱穩(wěn)定性、帶電情況、定性、帶電情況、pH和鹽濃度對其活性和溶解度的和鹽濃度對其活性和溶解度的影響。一般情況下，帶負電的物質(zhì)用陰離子交換劑影響。一般情況下，帶負電的物質(zhì)用陰離子交換劑，反之，則用陽離子交換劑。實驗室中最廣泛使用，反之，則用陽離子交換劑。實驗室中最廣泛使用的是的是DEAE和和CM 交換劑。交換劑。 2、交換顆粒大小的選擇、交換顆粒大小的選擇 粒子大小主要影響分辨率和流速。粗

16、粒粒子大小主要影響分辨率和流速。粗粒子：交換容量小、間隙大、分辨率底、流速較子：交換容量小、間隙大、分辨率底、流速較快。細粒子：分辨力高、交換容量大但是流快。細粒子：分辨力高、交換容量大但是流速慢。速慢。3、層析緩沖液的選擇、層析緩沖液的選擇 選擇正確的緩沖液可獲得較好的層析效果。因為選擇正確的緩沖液可獲得較好的層析效果。因為離子相互作用取決于離子相互作用取決于pH，而維持介質(zhì)的，而維持介質(zhì)的pH，通常是由，通常是由緩沖液來實現(xiàn)的。所用緩沖液的種類、緩沖液來實現(xiàn)的。所用緩沖液的種類、pH大小，決定大小，決定 待分離組分的穩(wěn)定性和溶解度。待分離組分的穩(wěn)定性和溶解度。 為避免緩沖液的離子參與離子交

17、換過程，采用緩沖為避免緩沖液的離子參與離子交換過程，采用緩沖液所帶的電荷應與離子交換劑所帶電荷相同。使用陽液所帶的電荷應與離子交換劑所帶電荷相同。使用陽離子交換劑時，要用陰離子型緩沖液（磷酸、醋酸等離子交換劑時，要用陰離子型緩沖液（磷酸、醋酸等）；使用陰離子交換劑時要用陽離子型緩沖液（）；使用陰離子交換劑時要用陽離子型緩沖液（Tris、胺鹽、吡啶等）。胺鹽、吡啶等）。 要得到好的分離效果，層析時要注意層析柱的高度和要得到好的分離效果，層析時要注意層析柱的高度和體積；上樣量的大??；洗脫液體積；洗脫速度；分級體積；上樣量的大??；洗脫液體積；洗脫速度；分級物的收集量。物的收集量。1、柱床體積：至少要

18、比結(jié)合所有樣品所需要的要大、柱床體積：至少要比結(jié)合所有樣品所需要的要大25倍。離子交換層析所用的柱不用太長，以便縮短操作倍。離子交換層析所用的柱不用太長，以便縮短操作時間。時間。2、樣品、樣品pH 和離子強度：與起始緩沖液具有相同的和離子強度：與起始緩沖液具有相同的pH和和離子強度。離子強度。3、洗脫液體積和洗脫梯度的形狀：對柱的分辨率影響很、洗脫液體積和洗脫梯度的形狀：對柱的分辨率影響很大。洗脫可用恒定組成的緩沖液來完成（簡單洗脫）大。洗脫可用恒定組成的緩沖液來完成（簡單洗脫）也可用改變也可用改變pH或鹽濃度，或二者均改變的洗脫液來完或鹽濃度，或二者均改變的洗脫液來完成。成。pH和鹽濃度的改

19、變又分為連續(xù)改變（梯度洗脫）和鹽濃度的改變又分為連續(xù)改變（梯度洗脫）和不連續(xù)改變（階段洗脫）和不連續(xù)改變（階段洗脫）。（四）柱層析技術（四）柱層析技術 交換劑的處理就是將交換劑轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合分離目的的離交換劑的處理就是將交換劑轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合分離目的的離子類型。一般包括除雜質(zhì)、溶脹，除細粒和改型。改型就子類型。一般包括除雜質(zhì)、溶脹，除細粒和改型。改型就是用適當?shù)碾x子平衡，使交換劑帶上希望的離子。陽離子是用適當?shù)碾x子平衡，使交換劑帶上希望的離子。陽離子和陰離子交換劑最后分別為和陰離子交換劑最后分別為Na和和Cl型是最穩(wěn)定形式。型是最穩(wěn)定形式。4、洗脫速度：太快或太慢都會降低柱的分辨率。、洗脫速度：太快或太

20、慢都會降低柱的分辨率。5、分級物收集量：關系到能否充分代表層析柱的分辨、分級物收集量：關系到能否充分代表層析柱的分辨率。一般總洗脫體積在率。一般總洗脫體積在5002000ml時，每管收集時，每管收集510ml（五）離子交換劑的處理和再生（五）離子交換劑的處理和再生 離子交換劑價格較貴，用后再經(jīng)過再生處理，可反離子交換劑價格較貴，用后再經(jīng)過再生處理，可反復多次使用。處理時避免用強酸或強堿長時間浸泡，復多次使用。處理時避免用強酸或強堿長時間浸泡，以防載體的糖鏈結(jié)構遭水解破壞。以防載體的糖鏈結(jié)構遭水解破壞。 劑型劑型處理用的酸或堿濃度處理用的酸或堿濃度浸泡時間浸泡時間纖維素纖維素 SephadexS

21、epharose合成凝膠合成凝膠0.5M HCl或或NaOH(含含0.5M NaCl)0.1M HCl或或NaOH(含含1M NaCl)1M NaAc (pH3.0)或或0.1M NaOH(含含1M NaCl)0.51.0M HCl或或NaOH(含含1M NaCl)34h0.5h可在柱中再生可在柱中再生長時間浸泡無影響長時間浸泡無影響各類離子交換劑的再生條件各類離子交換劑的再生條件 血清蛋白常用離子交換層析分離。血清蛋白常用離子交換層析分離。IgG可用可用QAESephadex A50或或DEAESephadex A50分離?，F(xiàn)在臨床上有重要用途的許多血清蛋白，分離?，F(xiàn)在臨床上有重要用途的許多

22、血清蛋白，如白蛋白，如白蛋白，factor IX復合物和專一性免疫球蛋白已復合物和專一性免疫球蛋白已用離子交換層析大規(guī)模生產(chǎn)。用離子交換層析大規(guī)模生產(chǎn)。（六）離子交換層系的應用實例（六）離子交換層系的應用實例 凝膠層析又稱凝膠滲透層析、排阻層析，分子篩凝膠層析又稱凝膠滲透層析、排阻層析，分子篩層析等。它主要用于分離分子大小不同的生物大分子層析等。它主要用于分離分子大小不同的生物大分子及測定其分子量。凝膠層析設備簡單，操作簡便，每及測定其分子量。凝膠層析設備簡單，操作簡便，每次層析后無需再生處理，因此，在生化研究中應用及次層析后無需再生處理，因此，在生化研究中應用及其廣泛。其廣泛。三、凝膠過濾層

23、析三、凝膠過濾層析 凝膠層析載體是多孔凝膠。當溶質(zhì)通過層析柱時，溶凝膠層析載體是多孔凝膠。當溶質(zhì)通過層析柱時，溶質(zhì)分子不僅是向下運動，而且還在做無定向擴散運動。質(zhì)分子不僅是向下運動，而且還在做無定向擴散運動。分子直徑比凝膠孔徑大的分子，不能進入凝膠顆粒的微分子直徑比凝膠孔徑大的分子，不能進入凝膠顆粒的微孔里，只能經(jīng)過凝膠顆粒之間的孔隙。這樣的分子是隨孔里，只能經(jīng)過凝膠顆粒之間的孔隙。這樣的分子是隨溶劑一起移動的，因而最先流出柱外；而分子直徑比凝溶劑一起移動的，因而最先流出柱外；而分子直徑比凝膠孔徑小的分子，則能夠自由進入凝膠顆粒的微孔之中膠孔徑小的分子，則能夠自由進入凝膠顆粒的微孔之中，即進入

24、凝膠相內(nèi)。小分子向下移動的速度必然要落后，即進入凝膠相內(nèi)。小分子向下移動的速度必然要落后于大分子。凝膠顆粒是固定相，洗脫液是流動相。于大分子。凝膠顆粒是固定相，洗脫液是流動相。 (一一) 基本原理基本原理 溶質(zhì)分子在柱上移動的速度（即被凝膠顆粒阻滯的程溶質(zhì)分子在柱上移動的速度（即被凝膠顆粒阻滯的程度）決定于該分子在兩相間的分配常數(shù)度）決定于該分子在兩相間的分配常數(shù) Kd。Kd由下式計由下式計算：算： Kd=(Ve-Vo)/Vp 式中式中Ve為某種物質(zhì)從柱內(nèi)完全洗脫出來時洗脫液的體為某種物質(zhì)從柱內(nèi)完全洗脫出來時洗脫液的體積；積；Vo為膠粒之間空隙的總?cè)莘e，也稱外水體積；為膠粒之間空隙的總?cè)莘e，也

25、稱外水體積；Vp為為膠粒內(nèi)部孔隙的總?cè)莘e，稱內(nèi)水體積。若分子大，完全不膠粒內(nèi)部孔隙的總?cè)莘e，稱內(nèi)水體積。若分子大，完全不能進入膠粒微孔，則最先流出柱，此時能進入膠粒微孔，則最先流出柱，此時Kd=0；若分子??；若分子小，能完全進入膠粒微孔，則最，能完全進入膠粒微孔，則最 后流出柱，此時后流出柱，此時Kd=1對中對中等大小的分子，只能部分進入膠粒微孔，所以等大小的分子，只能部分進入膠粒微孔，所以Kd值在值在01之間。不同溶質(zhì)是按之間。不同溶質(zhì)是按Kd由小到大的順序流出柱。由小到大的順序流出柱。 凝膠過濾法的分辨率是凝膠層析中的另一個重要的特凝膠過濾法的分辨率是凝膠層析中的另一個重要的特征性常數(shù)。從

26、數(shù)學概念上考慮，分離分辨率可以表示為：征性常數(shù)。從數(shù)學概念上考慮，分離分辨率可以表示為： V1、V2是兩種物質(zhì)的洗脫體積，可以從加樣品開始是兩種物質(zhì)的洗脫體積，可以從加樣品開始到洗脫峰的最高點為止的洗脫體積計算。到洗脫峰的最高點為止的洗脫體積計算。W1、W2分別為兩個物質(zhì)的洗脫峰的寬度，可以由通過分別為兩個物質(zhì)的洗脫峰的寬度，可以由通過峰邊拐點的兩條切線與基線交點間的距離來計算。兩峰邊拐點的兩條切線與基線交點間的距離來計算。兩個物質(zhì)要完全分離，個物質(zhì)要完全分離，必須大于或等于必須大于或等于1。影響分辨率。影響分辨率的因素很多，如凝膠粒度、上樣量、流速、溫度、的因素很多，如凝膠粒度、上樣量、流速、溫度、凝膠凝膠類型及層析柱的形狀等。類型及層析柱的形狀等。=2（V2-V1)W1+W2（二）離子交換劑的基本類型（二）離子交換劑的基本類型 根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì)，離子交換劑可被分為根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì)，離子交換劑可被分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。若按酸堿性的強弱，又陽離子交換劑和陰離子交換劑。若按酸堿性的強弱，又可分為強酸、強堿、弱酸、弱堿幾種類型的離子交換劑可分為強酸、強堿、弱酸、弱堿幾種類型的離子交換劑。 強酸和強堿型交換劑能在較廣泛的強酸和強堿型交換劑能在較廣泛的pH范圍內(nèi)（范圍內(nèi)（pH212）完全解