第07章 海洋藻類(lèi)Crypthecodinium cobnii 異養(yǎng)生長(zhǎng)生產(chǎn)二十二碳六烯酸可用的替代碳源佘雋

1、第七章 海洋藻類(lèi)Crypthecodinium cobnii異養(yǎng)生長(zhǎng)生產(chǎn)二十二碳六烯酸可用的替代碳源前言近年來(lái)，多不飽和脂肪酸備受關(guān)注，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)谌梭w中的有著各種生理功能，且有益人類(lèi)健康。至今，魚(yú)油是主要的脂肪酸；一些海洋微藻種的單細(xì)胞油脂（SCO）也含有重要的多不飽和脂肪酸。在本書(shū)的各章節(jié)中，這些油是主要的脂肪酸來(lái)源。重要的異養(yǎng)海洋生物甲藻，Crypthecodinium cobnii，相關(guān)研究很多。這僅是多不飽和脂肪酸的一類(lèi)單細(xì)胞油脂DHA，C.cobnii 中積聚了高含量的DHA脂肪酸總量的25-60%。優(yōu)化DHA生產(chǎn)的重要參數(shù)，包括生長(zhǎng)率、初始生物量、總脂含量以及脂類(lèi)中DHA比例。

2、大部分商業(yè)化的培養(yǎng)過(guò)程中，葡萄糖是主要的碳源和能源。葡萄糖是工業(yè)生產(chǎn)中容易獲得的原料，從谷物淀粉中通過(guò)水解（化學(xué)、酶解）得到葡萄糖漿。成本低、獲取方便、能濃縮儲(chǔ)存，以溶液滅菌，性質(zhì)穩(wěn)定。制成水溶液便于發(fā)酵，且滅菌容易，傳輸?shù)阶罱K的發(fā)酵罐中是單一的溶液。但它不可能僅滿(mǎn)足作為底物的條件。這一章討論了利用替代碳源-乙酸和乙醇-生長(zhǎng)，脂類(lèi)積聚，DHA生產(chǎn)， C.cobnii批量分批補(bǔ)料式培養(yǎng)培養(yǎng)。通常也將葡萄糖作為可用的原料。乙酸在石化工業(yè)中生產(chǎn)的比例很大，其成本是葡萄糖的三倍，大約600美元/t。發(fā)酵中大比例使用有缺陷，以濃縮的方式，要求操作小心，任何溢出物或接觸到皮膚必須迅速處理。將其歸類(lèi)為“強(qiáng)酸

3、”，它沒(méi)有鹽酸或硝酸這些無(wú)機(jī)酸攻擊性強(qiáng)。因此，大量使用時(shí)不需要緊急警告。乙醇能通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)，在巴西、新西蘭、美國(guó)廣泛生產(chǎn)，被視為“汽油醇”。因?yàn)槭怯闷咸烟前l(fā)酵生產(chǎn)，其成本高于葡萄糖。“食品級(jí)”乙醇，需要滿(mǎn)足 “食品級(jí)”DHA生產(chǎn)，售價(jià)760-800美元/t，現(xiàn)在比乙酸更貴。這些底物，如葡萄糖，是水溶液，因此混在發(fā)酵媒介中沒(méi)有問(wèn)題。這些底物都是“純品”，作為人類(lèi)消費(fèi)品生產(chǎn)也是適當(dāng)?shù)?。他們沒(méi)有殘留，沒(méi)有未發(fā)酵的化合物，最終的廢物可以最小限度處理。分批補(bǔ)料式培養(yǎng)培養(yǎng)中 ，這些底物都可使用，其優(yōu)點(diǎn)是可以自身消毒，減少污染的風(fēng)險(xiǎn)。使用替代碳源用乙酸或乙醇作為發(fā)酵分批補(bǔ)料式培養(yǎng)替代葡萄糖，總體來(lái)看在改進(jìn)生

4、產(chǎn)上減少了成本。如果使用替代分批補(bǔ)料式培養(yǎng)，產(chǎn)量提高，附加產(chǎn)物回收的優(yōu)點(diǎn)，或改進(jìn)發(fā)酵蒸汽產(chǎn)生的廢棄物處理方法，可以額外鼓勵(lì)轉(zhuǎn)換底物。這樣來(lái)看，替代分批補(bǔ)料式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)與原料生產(chǎn)成本沒(méi)有太大的相關(guān)性。在以乙酸和乙醇為底物時(shí)，不像葡萄糖，可以馬上注意到，這些原料濃度高出1-2%對(duì)大部分細(xì)胞是有毒的。在發(fā)酵過(guò)程中使用很少的碳底物是不實(shí)際的（最終細(xì)胞生物量得率不能超過(guò)5g/L）。這個(gè)過(guò)程中，附加的底物供給到發(fā)酵罐，保持底物濃度在限制生長(zhǎng)的濃度之下?，F(xiàn)在的問(wèn)題是如何達(dá)到附加的濃度，另外，不能超過(guò)限制生長(zhǎng)的濃度的?？梢杂孟旅娴男袆?dòng)表明，這不是不能控制的任務(wù)。事實(shí)上，大部分工業(yè)化發(fā)酵過(guò)程使用分批補(bǔ)料式

5、培養(yǎng)工藝模型來(lái)優(yōu)化生產(chǎn)，這就表示可以在許多引用單元中使用乙酸和乙醇作為底物。使用乙酸 當(dāng)濃度超過(guò)5-10g/L時(shí)，乙酸對(duì)許多微藻有毒，少量的有機(jī)體，能在高于20g/L，甚至在中性條件下時(shí)生長(zhǎng)。Vazhappily 和Chen就乙酸對(duì)于C.cobnii及其他微藻的毒性做了一些初步研究，研究表明C.cobnii能在濃度不超過(guò)1g/L的醋酸鹽中生長(zhǎng)；因?yàn)榕囵B(yǎng)基質(zhì)中有其他碳源，結(jié)果不完全清楚。一些初步的實(shí)驗(yàn)室研究表明C.cobnii 能在3g/L的乙酸鈉中生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)對(duì)pH要求嚴(yán)格。這些問(wèn)題在使用乙酸作為分批補(bǔ)料式培養(yǎng)時(shí)都是很關(guān)鍵的。當(dāng)添加到發(fā)酵基質(zhì)中，乙酸被中和或帶進(jìn)平衡離子，通常是Na+或K+。當(dāng)

6、細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，乙酸鹽（CH3COO-）消耗，被氫氧離子（OH-）取代，結(jié)果導(dǎo)致pH升高。事實(shí)上，NaOH是乙酸鹽的消耗產(chǎn)物。這件快速增長(zhǎng)pH值，制止細(xì)胞生長(zhǎng)。如果要避免pH值的風(fēng)險(xiǎn)，必須用酸滴定的方法；有沒(méi)有比乙酸更好的酸？乙酸的容器附在發(fā)酵罐上并帶有pH計(jì)和劑量泵。這些設(shè)備能按需要將乙酸加到發(fā)酵基質(zhì)中。在初步研究中，不管C.cobnii在乙酸鹽中的不確定生長(zhǎng)，乙酸鹽能用作碳源和pH連續(xù)文化設(shè)備，一個(gè)適當(dāng)可行的評(píng)估系統(tǒng)，用于生產(chǎn)富集DHA的單細(xì)胞油脂。最佳的生產(chǎn)率是初始濃度達(dá)到8g乙酸鹽/L(圖7.1)。細(xì)胞的脂類(lèi)含量只有微小變化（45-50%生物量），初始乙酸鹽濃度達(dá)到12g/L，油中DHA含

7、量沒(méi)有實(shí)際的變化（40-50%）。圖 7.1 （A）生長(zhǎng)率，（B）細(xì)胞中脂類(lèi)含量，（C）DHA在脂肪酸總量中含量。C.cobnii在pH6.5，連續(xù)文化設(shè)備下的乙酸鈉中培養(yǎng)。圖 7.2 純乙酸分批補(bǔ)料式培養(yǎng)培養(yǎng)C.cobnii。培養(yǎng)基：10g/L酵母提取物/L,25g海鹽/L,8gNaAc/L;10%(V/V)接種物。（A）添加乙酸的生物量干重（DW）;(B)干基中脂類(lèi)含量，脂類(lèi)中DHA含量；（C）脂類(lèi)含量，DHA（rDHA）生產(chǎn)力總?cè)萘亢虳HA濃度。表7.A C.cobnii ATCC30772在葡萄糖和pH連續(xù)文化設(shè)備下培養(yǎng)，總脂質(zhì)和中性脂質(zhì)的脂肪酸分布（%W/W） 總體而言，這個(gè)系統(tǒng)的結(jié)

8、果優(yōu)于使用葡萄糖作原料的。生長(zhǎng)率提高60%，細(xì)胞脂質(zhì)增加70%，TFA中DHA增長(zhǎng)50%（表7.A）。這些增長(zhǎng)表明在這些細(xì)胞的TAG碎片中，DHA的水平更高。作者解釋使用乙酸鹽改進(jìn)C.cobnii，與葡萄糖相比，至少部分是由于它總是在最大可能的速度增長(zhǎng)。這一發(fā)現(xiàn)被Swaaf 等證實(shí)，他們采用長(zhǎng)期培養(yǎng)（達(dá)400h）細(xì)胞生物量回收率為109g/L(圖7.2)。然而，這種高密度培養(yǎng)所需的混和物，以維持充足的有氧條件，這種氧氣進(jìn)入系統(tǒng)的傳遞是由復(fù)雜培養(yǎng)粘度增加，這種粘度增加是對(duì)胞外多糖生產(chǎn)的結(jié)果。工業(yè)上生產(chǎn)DHA，培養(yǎng)一個(gè)商業(yè)化的多糖水解酶制劑，能降低粘度。需要保持一個(gè)固定的溶解氧濃度，才能降低攪拌速

9、度。圖 7.3 C.cobnii在乙酸和乙醇中可能的DHA生物合成途徑。C.cobnii含量低的其他原因可能是培養(yǎng)時(shí)分泌了琥珀酸，作者沒(méi)有注意到在乙酸鹽pH連續(xù)文化設(shè)備控制下，發(fā)酵罐中乙酸鹽濃度沒(méi)有與時(shí)間一致，實(shí)際上，從8g乙酸鹽/L到1g/L階段性遞減，不管新加入的乙酸濃度。這種下降表明，有一成的一些細(xì)胞外代謝產(chǎn)物乙酸，已證實(shí)是聚丁二酸高達(dá)5克/ L的，這種積累是由于一個(gè)限速步驟存在，作為三羧酸循環(huán)的一部分轉(zhuǎn)化琥珀酸酸富馬酸（圖 7.3）。它加劇了醋酸細(xì)胞生長(zhǎng)，其中有兩條路線現(xiàn)在生產(chǎn)琥珀酸：一個(gè)來(lái)自異檸檬酸裂合酶以及2-酮戊二酸之一。解決方法是積累琥珀酸（這顯然是醋酸的浪費(fèi)，至少部分的醋酸生

10、物產(chǎn)量低），添加1（v / V）丙酸到介質(zhì)。圖7.4顯示了在這些條件下的生物性能的提高。底物生物量增加到約50g/L，總脂達(dá)到60的細(xì)胞生物量。DHA含量在脂類(lèi)中依然保持適當(dāng)?shù)?5-40%（表7.B）。與預(yù)料的相反，增加丙酸鹽劑量在脂類(lèi)中不適用于奇數(shù)鏈長(zhǎng)的脂肪酸（表7.B）。增加的丙酸鹽用于用于細(xì)胞代謝等其他方面，這可以明顯改善碳源。乙醇作為碳源乙醇考慮作為生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的有潛力的原料，在70年代和80年代在捷克、俄羅斯、日本，在工作中采用。用了一些特別的油脂性的酵母。在這些研究中，Yamauchi等用計(jì)算機(jī)控制，批量分批補(bǔ)料式培養(yǎng)發(fā)酵。這一技術(shù)對(duì)細(xì)胞密度有要求：153g/L超過(guò)140h，細(xì)胞

11、油脂含量超過(guò)50%。C.cobnii生產(chǎn)DHA，作者之前鑒定以培養(yǎng)比例和生產(chǎn)容量作主要因素，在過(guò)程中是可行的。明顯的， DHA含量高，生物量也高，這在產(chǎn)品回收時(shí)也描述了。以實(shí)驗(yàn)室的比例培養(yǎng)，C.cobnii ATCC30772 中rDHA報(bào)道的葡萄糖是19mgL-1h-1，用葡萄糖 (50%w/v)分批補(bǔ)料式培養(yǎng)生產(chǎn)，生產(chǎn)力相似。以乙酸作為碳源，在pH連續(xù)文化設(shè)備控制下批量培養(yǎng)，獲得48mg DHA h-1L-1產(chǎn)量（圖7.2和圖7.4）。這一發(fā)現(xiàn)表明用C.cobnii生產(chǎn)DHA，碳源影響很大。和乙酸類(lèi)似，乙醇也是C.cobnii的潛在碳源，經(jīng)證實(shí)其對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，能進(jìn)入細(xì)胞并引發(fā)代謝。乙醇的利用

12、表明醇脫氫酶的存在，轉(zhuǎn)換乙醇為乙醛，乙醛脫氫酶將轉(zhuǎn)換乙醛為醋酸（圖7.3）。作為一個(gè)大面積種植碳源，乙醇可能比醋酸有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗軌虍a(chǎn)生較高的生物量。特別是乙醇的易燃性質(zhì)-具體要求儲(chǔ)存及大規(guī)模應(yīng)用。此外，乙醇作為發(fā)酵原料，需要設(shè)備以及另外一個(gè)控制系統(tǒng)，在生物反應(yīng)器中控制適度的酒精濃度。C.cobnii對(duì)乙醇的利用在最初的搖瓶培養(yǎng)中進(jìn)行了研究。藻類(lèi)生長(zhǎng)在一個(gè)復(fù)雜培養(yǎng)基中，含有酵母提取物，海鹽和變化的乙醇濃度。酵母提取物作為單一碳源中是可忽略的。5g/L或10g/L濃度下，細(xì)胞生長(zhǎng)良好（圖7.5）。在這些乙醇濃度下，用生長(zhǎng)曲線的指數(shù)來(lái)計(jì)算生長(zhǎng)率。與5g乙醇/L培養(yǎng)對(duì)比，10g乙醇/L下，顯示有一個(gè)

13、明顯的延長(zhǎng)期。乙醇濃度為15g /L或更高時(shí)，C.cobnii 生長(zhǎng)實(shí)際上減弱了。這些數(shù)據(jù)表明乙醇和乙酸一樣，不能直接用于分批培養(yǎng)以達(dá)到高的生物量濃度。圖 7.4 C.cobnii ATCC 30772在pH連續(xù)文化設(shè)備下培養(yǎng)，乙酸作分批補(bǔ)料式培養(yǎng)，10g/L圖 7.5 初始乙醇濃度對(duì)C.cobnii搖瓶培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響。培養(yǎng)基：2g/L酵母提取物；25g海鹽/L;10%（V/V）接種物。乙醇以0、5、10、15、25g/L濃度添加進(jìn)培養(yǎng)基中。吸光度（OD）值相對(duì)1g/L的細(xì)胞干重為1。為了避免毒性，供給充足的能量，生長(zhǎng)和代謝活力，de Swaaf等在一個(gè)2L的計(jì)算機(jī)控制的實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器中改進(jìn)

14、了乙醇分批補(bǔ)料式培養(yǎng)工藝。脂類(lèi)生產(chǎn)要求提供充足的氧氣，溶解氧濃度（DOT）保持超過(guò)30%的空氣飽和度。這一目標(biāo)可以通過(guò)控制攪拌速度（范圍：200-1250rpm），通過(guò)濾法消毒的空氣來(lái)實(shí)現(xiàn)。初始培養(yǎng)基中含乙醇5.5g/ L開(kāi)始接種。相對(duì)于前面介紹的乙酸的過(guò)程，乙醇還有一點(diǎn)是不能通過(guò)改變pH值來(lái)控制。因此，作者根據(jù)溶解氧濃度改進(jìn)了乙醇自動(dòng)補(bǔ)料系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)中增加了一個(gè)滅菌的乙醇傳感器，結(jié)果也和以前相似。 C.cobnii在乙醇分批補(bǔ)料式培養(yǎng)下，300g乙醇添加到發(fā)酵罐中超過(guò)220h的發(fā)酵時(shí)間（圖7.6）。預(yù)計(jì)在前52h中生長(zhǎng)率為0.047h-1,這與乙醇搖瓶培養(yǎng)的生長(zhǎng)率很相似（圖7.5）。比較葡

15、萄糖生長(zhǎng)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)較低的最高生長(zhǎng)率。在50h和150h之間，生物量濃度增加緩慢，表明生長(zhǎng)被抑制，可能是因?yàn)檠鯕獾墓┙o和吸收。生物量濃度水平增加（圖7.6）。在這段時(shí)間內(nèi)的脂質(zhì)生物量從9提高到35%，42在發(fā)酵過(guò)程結(jié)束時(shí)達(dá)到終值（圖7.6）。在這一過(guò)程的第一個(gè)120小時(shí)，脂質(zhì)DHA含量在44和32之間變化，在最后100小時(shí)它保持在33不變（圖7.6）。最終細(xì)胞干重，脂類(lèi)，DHA含量分別為83,35，和11.7g/L（圖7.6）。后面的值導(dǎo)致DHA生產(chǎn)容量（rDHA）為53mgL-1h-1。生物量以乙醇計(jì)算為0.31g生物量/g乙醇，大約比用乙酸計(jì)算高2.4倍。圖 7.6 用純乙醇對(duì)C.co

16、bnii分批補(bǔ)料式培養(yǎng)。A.乙醇遞增時(shí)生物量干重（DW）;B.生物量干重中脂類(lèi)含量，脂類(lèi)中DHA含量；C.脂類(lèi)濃度，DHA生產(chǎn)容量（rDHA），DHA濃度。C2碳源生產(chǎn)脂類(lèi)與葡萄糖相比，乙酸和乙醇作為C.cobnii的碳源導(dǎo)致DHA明顯增加(表7.c)。主要原因是乙酸和乙醇直接投料到乙酰輔酶A中提高了生產(chǎn)率(圖7.3)。這種能力可以維持高濃度代謝產(chǎn)物，因此在其他的評(píng)論中C.cobnii的脂類(lèi)生物合成是決定性的。在葡萄糖生長(zhǎng)細(xì)胞中，碳的主通量包括葡萄糖吸收，運(yùn)輸丙酮酸到線粒體，檸檬酸傳輸?shù)郊?xì)胞液（ATP）: 檸檬酸裂解酶產(chǎn)生乙酰輔酶A。這在其他微生物的脂類(lèi)合成中已經(jīng)研究了。假設(shè)一個(gè)相似的C.co

17、bnii生物合成DHA的代謝系統(tǒng)（這可能是很大的假設(shè)），相比使用乙酸，能生產(chǎn)更高得率的其他細(xì)胞或DHA（或兩者都有）。出現(xiàn)這種情況是因?yàn)橐掖急纫宜岬挠昧可?，比乙酸鹽能耗少以這種方式減少還原型輔酶（NADH），大量的乙酸鹽需要將乙酰輔酶A傳輸?shù)街舅嶂?。但NADH還未使用，需要含有蘋(píng)果酸酶、丙酮酸鹽的表 7.B C.cobnii在乙酸pH連續(xù)文化設(shè)備下生長(zhǎng)分析，培養(yǎng)基含1%（V/V）丙酸表 7.C 比較C.cobnii在葡萄糖（50%，V/V）,乙酸pH連續(xù)文化設(shè)備，乙醇補(bǔ)料分批培養(yǎng)循環(huán)傳輸轉(zhuǎn)氫酶(圖7.3)。乙醇不僅能生產(chǎn)乙酸鹽-乙酰輔酶A（以乙酸鹽劑量），更重要的是，它產(chǎn)能比乙酸鹽高，單位重

18、量細(xì)胞的得率也更高。無(wú)論是使用乙醇或乙酸作為為DHA的規(guī)?；a(chǎn)的基材，事實(shí)上，要取代葡萄糖，必須等待適當(dāng)?shù)纳虡I(yè)利益的發(fā)展。這可能是乙醇的轉(zhuǎn)化脂質(zhì)的效率大大低于葡萄糖和醋酸，因此可能代表了單細(xì)胞油脂生產(chǎn)的最經(jīng)濟(jì)的原料。甘油作碳源由于當(dāng)前從生物柴油中生產(chǎn)粗甘油的豐富而廉價(jià)，有可能使用它作為多種發(fā)酵投料，包括在單細(xì)胞油脂中使用選擇性的碳源。Meesters 和 Yokochi 等分別在Cryptococcus curvatus 和Schizochytrium limacinuum中使用純化甘油生產(chǎn)單細(xì)胞油脂。雖然我們沒(méi)有生物柴油衍生的甘油作為碳源用于C.cobnii生長(zhǎng)和DHA生產(chǎn)的數(shù)據(jù)，也沒(méi)有獲得任何公告覆蓋這個(gè)主題。我們相信甘油能像葡萄糖一樣有效生產(chǎn)生物質(zhì)和脂類(lèi)。葡萄糖轉(zhuǎn)化生物質(zhì)的產(chǎn)率系數(shù)通常在0.4-0.5g細(xì)胞/葡萄糖，甘油的得率可能與之相同。因?yàn)楦视偷男屎痛x是葡萄糖的一半。因此，像葡萄糖用于主要的糖酵解途徑，在轉(zhuǎn)化