大小型層析柱的裝填實(shí)踐介紹(中文)

1、 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHA. Sprauer 5/06TOYOPEARL樹脂填料樹脂填料大小型工業(yè)制備色譜柱的裝填實(shí)踐大小型工業(yè)制備色譜柱的裝填實(shí)踐 GtecPallGE HealthcarePall-Euroflow / Resolute TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHTOYOPEARL樹脂填料的裝填樹脂填料的裝填 裝填前的準(zhǔn)備工作裝填前的準(zhǔn)備工作 小顆粒的去除小顆粒的去除 緩沖液平衡緩沖液平衡 勻漿準(zhǔn)備勻漿準(zhǔn)備 裝填步驟裝填步驟 / 層析柱類型層析柱類型 層析柱的操作層析柱的

2、操作 柱子的平衡與柱效評(píng)價(jià)柱子的平衡與柱效評(píng)價(jià) 保存保存內(nèi)容提要內(nèi)容提要Peak Biotech TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH裝填的一般原則裝填的一般原則TOYOPEARL的裝填壓力最好在的裝填壓力最好在0.5 - 5 bar的范圍內(nèi)的范圍內(nèi)裝填流速至少比實(shí)際操作流速高裝填流速至少比實(shí)際操作流速高50%不要使用會(huì)產(chǎn)生剪切力的裝置不要使用會(huì)產(chǎn)生剪切力的裝置（如：磁力攪拌器、（如：磁力攪拌器、 齒輪泵）齒輪泵） - 這些裝置會(huì)磨碎樹脂填料并產(chǎn)生小顆粒這些裝置會(huì)磨碎樹脂填料并產(chǎn)生小顆粒 TOYOPEARL是一種剛性強(qiáng)的樹脂填料，裝填時(shí)務(wù)必是一種

3、剛性強(qiáng)的樹脂填料，裝填時(shí)務(wù)必區(qū)別于一般的軟式瓊脂糖凝膠區(qū)別于一般的軟式瓊脂糖凝膠 Superformance / GtecTOYOPEARL樹脂填料的裝填樹脂填料的裝填 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH基本步驟基本步驟去除小顆粒去除小顆粒裝填緩沖液平衡裝填緩沖液平衡勻漿準(zhǔn)備勻漿準(zhǔn)備裝柱裝柱TOYOPEARL出貨時(shí)為懸出貨時(shí)為懸浮液狀態(tài)（含浮液狀態(tài)（含20%乙醇）乙醇）TOYOPEARL樹脂填料的裝填樹脂填料的裝填 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH裝柱前務(wù)必進(jìn)行小顆粒去除的操作裝柱前務(wù)必進(jìn)行小

4、顆粒去除的操作! 小顆粒的存在會(huì)阻塞篩板或燒結(jié)板，并最終會(huì)導(dǎo)致整個(gè)柱子的壓降增大小顆粒的存在會(huì)阻塞篩板或燒結(jié)板，并最終會(huì)導(dǎo)致整個(gè)柱子的壓降增大 小顆粒的去除采取懸浮靜置移注法小顆粒的去除采取懸浮靜置移注法 重復(fù)這一步驟不少于重復(fù)這一步驟不少于3次次借助顯微鏡可檢借助顯微鏡可檢查小顆粒的存在查小顆粒的存在小顆粒的去除小顆粒的去除 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHTOYOPEARL 粒徑粒徑Coarse C級(jí)規(guī)格: 100 mMedium M級(jí)規(guī)格: 65 mFine F級(jí)規(guī)格: 45 mSuperfine S級(jí)規(guī)格: 35 m水中靜置時(shí)間水中靜

5、置時(shí)間15-30 Min.30-45 Min.45-60 Min.60-90 Min.Amicon Moduline-120cm ID顯微鏡微觀顯示 Toyopearl 650 MTOYOPEARL的靜置時(shí)間的靜置時(shí)間 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH 在去除小顆粒時(shí)的最后一次步驟中可加入裝填緩沖液進(jìn)行填料的在去除小顆粒時(shí)的最后一次步驟中可加入裝填緩沖液進(jìn)行填料的平衡平衡 最好根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)中所使用的緩沖液選取合適的裝填緩沖溶液最好根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)中所使用的緩沖液選取合適的裝填緩沖溶液 一般來(lái)講，分離純化工藝中將使用到的最高離子強(qiáng)度的流動(dòng)相是一般來(lái)

6、講，分離純化工藝中將使用到的最高離子強(qiáng)度的流動(dòng)相是裝填緩沖液的首選裝填緩沖液的首選這一操作可以將填料裝得最為緊密，并且可以防止死體積的發(fā)生或膠體內(nèi)溝槽這一操作可以將填料裝得最為緊密，并且可以防止死體積的發(fā)生或膠體內(nèi)溝槽的出現(xiàn)。的出現(xiàn)。裝填緩沖液的平衡裝填緩沖液的平衡 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHTOYOPEARL-典型的裝填緩沖溶液典型的裝填緩沖溶液 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH 利用量筒測(cè)量靜置膠體體積或使用水泵抽濾漿液至濕濾餅利用量筒測(cè)量靜置膠體體積或使用水泵抽濾漿液至濕濾餅后計(jì)

7、算裝填所需要的填料體積后計(jì)算裝填所需要的填料體積 通過(guò)添加裝填緩沖液調(diào)節(jié)漿液濃度通過(guò)添加裝填緩沖液調(diào)節(jié)漿液濃度:-流動(dòng)式裝填柱流動(dòng)式裝填柱 40 - 70% (v/v) -自動(dòng)裝填柱自動(dòng)裝填柱 20 - 60% (v/v) 最終裝填好的柱床體積是要小于裝填前膠體靜置體積或抽最終裝填好的柱床體積是要小于裝填前膠體靜置體積或抽干的濕濾餅的體積干的濕濾餅的體積Slurry preparation in the columnSlurry preparation in a separate tankSettling resinAmicon Moduline-120cm ID勻漿準(zhǔn)備勻漿準(zhǔn)備 TOSOH

8、BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHToyopearlHW-40, HW-50, HW-55HW-65 and HW-75FEther-650, Phenyl-650Butyl-650, DEAE-650Super-Q-650, CM-650SP-650 and all AffinityQAE-550C and SP-550C使用約使用約1.1倍柱體積的靜置膠倍柱體積的靜置膠使用約使用約1.2倍柱體積的靜置膠倍柱體積的靜置膠使用約使用約1.25-1.4倍柱體積的靜置膠倍柱體積的靜置膠對(duì)于給定的柱子，裝柱所需的靜置膠體積對(duì)于給定的柱子，裝柱所需的靜置膠體積 T

9、OSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHo 恒流速裝填法恒流速裝填法o 恒壓裝填法恒壓裝填法o 輔助的重力沉降裝填法輔助的重力沉降裝填法不同裝填方法的特點(diǎn)不同裝填方法的特點(diǎn)裝填方法裝填方法 恒流速恒流速 恒壓恒壓 重力沉降重力沉降 裝填速度裝填速度 快快快快 慢慢流速范圍流速范圍 可增大至較高可增大至較高 可增大至較高可增大至較高 只能慢操作只能慢操作重復(fù)性重復(fù)性 很好很好很好很好 好好泵泵恒速恒速 恒壓恒壓 蠕動(dòng)泵蠕動(dòng)泵壓力計(jì)壓力計(jì) 需要需要需要需要 不需要不需要主要裝填方法主要裝填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOS

10、CIENCE GmbH方法簡(jiǎn)介方法簡(jiǎn)介: 將柱底篩板用裝填緩沖液潤(rùn)濕（趕走氣泡）將柱底篩板用裝填緩沖液潤(rùn)濕（趕走氣泡） 任何時(shí)候，均需確保漿液在注入層析柱前進(jìn)行過(guò)勻漿操作任何時(shí)候，均需確保漿液在注入層析柱前進(jìn)行過(guò)勻漿操作 勻漿液倒入后，立刻將分配器置于儲(chǔ)槽內(nèi)漿液表面勻漿液倒入后，立刻將分配器置于儲(chǔ)槽內(nèi)漿液表面 分配器與溶液漿液間不應(yīng)有氣泡存在分配器與溶液漿液間不應(yīng)有氣泡存在 階段性調(diào)整裝填流速至目標(biāo)流速，以產(chǎn)生一個(gè)實(shí)時(shí)的、沒有太大振動(dòng)階段性調(diào)整裝填流速至目標(biāo)流速，以產(chǎn)生一個(gè)實(shí)時(shí)的、沒有太大振動(dòng)的栓塞流的栓塞流 在最初的壓實(shí)操作基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步壓實(shí)柱床，至少泵入在最初的壓實(shí)操作基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步壓

11、實(shí)柱床，至少泵入5-10倍柱體倍柱體積的裝填緩沖液積的裝填緩沖液 調(diào)整分配器至膠體表面調(diào)整分配器至膠體表面 重復(fù)后兩個(gè)步驟，直至柱床被徹底壓實(shí)。最后將分配器移至距離柱床重復(fù)后兩個(gè)步驟，直至柱床被徹底壓實(shí)。最后將分配器移至距離柱床2-5 mm 處（最后一次）。不要擔(dān)心使用分配器的同時(shí)進(jìn)行柱床的壓處（最后一次）。不要擔(dān)心使用分配器的同時(shí)進(jìn)行柱床的壓實(shí)操作！實(shí)操作！MilliporeQuik ScaleFlow Packed Columns (Millipore-QuikScale+Moduline, GE Healthcare-BPG, Gtec-Superformance, BioRad-Gel

12、tec, etc.)恒流速裝填方法恒流速裝填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH模式填料類型柱尺寸cm ID x L填料等級(jí)裝填流速cm/h操作流速 cm/hSECHW-40HW-50HW-55HW-65HW-752,2 x 602,2 x 602,2 x 602,2 x 602,2 x 60S (30 um)F (45 um)C (75 um)S (30 um)F (45 um)S (30 um)F (45 um)S (30 um)F (45 um)F (45 um)30 4060 80120 16025 3550 7025 3550 7

13、020 7540 15040 15010 2525 5050 10010 2025 3510 2025 3510 1515 3015 30IECDEAE-650, SuperQ-650CM-650, SP-650SP-550, QAE-550MegaCap II SP-5502,2 x 202,2 x 202,2 x 20S (35 um)M (65 um)C (100 um)C (100 um)EC (100-300 um)400 600800 1000800 1200700 1000800 120045 6580 13080 60080 24080 500HICEther-650, Phe

14、nyl-650, Butyl-650 PPG-600, Butyl-600SuperButy-550, Hexyl-5502,2 x 202,2 x 202,2 x 20S (35 um)M (65 um)C (100 um)M (65 um)C (100 um)400 600800 1000800 1200800 1000800 120045 6580 13080 50080 13080 500AFCAF-Amino-650, AF-Carboxy-650AF-Formyl-650, AF-Epoxy-650AF-Tresyl-650, AF-Chelate-650, AF-Blue HC-

15、650, AF-Heparin-HC-650AF-Red-6502,2 x 10M (65 um)800 100030 130實(shí)驗(yàn)室規(guī)模最優(yōu)化的裝填及柱操作流速實(shí)驗(yàn)室規(guī)模最優(yōu)化的裝填及柱操作流速 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH柱尺寸(I.D. x L)2.2 cm x 60 cm9 cm x 30 cm25 cm x 30 cm填料類型HW-55SQAE-550CDEAE-650M目標(biāo)流速 (ml/min)23002000增加量(ml/min) 0.5 50 500 保持時(shí)間(min) 0.5 2 2 恒流速裝填法中流速的增加量舉例：恒流速

16、裝填法中流速的增加量舉例：恒流速裝填方法恒流速裝填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHGtec/Superformance 20cm ID Column氣泡會(huì)由于切換閥、管路連接處、 活塞運(yùn)動(dòng)、未脫氣緩沖液而引起.恒流速裝填方法恒流速裝填方法- 擾動(dòng)擾動(dòng)（由入口處篩板下氣泡而引起的）（由入口處篩板下氣泡而引起的） TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH裝填裝填運(yùn)行運(yùn)行管路清洗管路清洗卸料卸料Horizontal Flow - “Self Packer” - preset column volum

17、e(Pall/Euroflow-ResoluteTM, Millipore-IsoPakTM, GE Healthcare-Chromaflow, Eastern River)優(yōu)點(diǎn)：易于裝填優(yōu)點(diǎn)：易于裝填弱點(diǎn)：填料用量較大弱點(diǎn)：填料用量較大, 卸料可能較難卸料可能較難, 有剪切力發(fā)生有剪切力發(fā)生, 卸料會(huì)導(dǎo)致大量的漿液體積卸料會(huì)導(dǎo)致大量的漿液體積Resolute恒壓裝填方法恒壓裝填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHRadial Flow - “Self Packer” - preset column volume (Proxcys-CRI

18、O)oLow space requirements only 0,51 m2; even 600 liter BV is mounted on wheelsoLarge inlet surface area cotrolled & gentle product application (“Natural Distribution”).oThin frit keeps the resin together it is not used as flow distributor a barrier of only 60um negligible influence on pressure g

19、eneration Identical pathlength for all substances A-ECRIO 601S5 liter BVCRIO - Colonne Radiale InOxidable恒壓裝填方法恒壓裝填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHDynamic Axial Compression (Novasep, Peak Biotech, Technikrom, GE Healthcare)UnpackingPneumatic/HydraulicSlurry transfer優(yōu)點(diǎn)：裝填操作簡(jiǎn)單，非常快優(yōu)點(diǎn)：裝填操作簡(jiǎn)

20、單，非?？烊秉c(diǎn)：卸料會(huì)導(dǎo)致大量的漿液體積缺點(diǎn)：卸料會(huì)導(dǎo)致大量的漿液體積(while column is assembled) ；不易操；不易操作作g (while disassembling the column), 卸料緩慢卸料緩慢Peak Biotech/Dan Process - DAC恒壓或恒流速裝填方法恒壓或恒流速裝填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH 不要使用沒有進(jìn)行正確柱效評(píng)價(jià)的層析柱不要使用沒有進(jìn)行正確柱效評(píng)價(jià)的層析柱! SEC、RPC及及HIC型層析柱的柱效與裝填質(zhì)量密型層析柱的柱效與裝填質(zhì)量密切相關(guān)的。切相關(guān)的。 只有

21、只有IEC和和AFC型層析柱，在沒有高塔板數(shù)時(shí)也能型層析柱，在沒有高塔板數(shù)時(shí)也能正常工作。盡管如此，對(duì)稱性因子還是相當(dāng)重要正常工作。盡管如此，對(duì)稱性因子還是相當(dāng)重要的。的。層析柱操作層析柱操作 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH 使用使用5-10倍柱體積的低離子強(qiáng)度緩沖液進(jìn)行柱子的平衡倍柱體積的低離子強(qiáng)度緩沖液進(jìn)行柱子的平衡 使用低分子量、無(wú)保留的化合物進(jìn)行柱效的測(cè)定（如：丙酮、鹽）使用低分子量、無(wú)保留的化合物進(jìn)行柱效的測(cè)定（如：丙酮、鹽） 進(jìn)樣體積為柱體積的進(jìn)樣體積為柱體積的0.25 - 1% 將測(cè)定而得的塔板數(shù)、不對(duì)稱性因子與廠家提供的最小

22、值相比較將測(cè)定而得的塔板數(shù)、不對(duì)稱性因子與廠家提供的最小值相比較 如果未達(dá)到最小塔板數(shù)等期望值，必須重新進(jìn)行柱子的裝填！如果未達(dá)到最小塔板數(shù)等期望值，必須重新進(jìn)行柱子的裝填！可供選擇的方法可供選擇的方法: 使用高離子強(qiáng)度的裝填緩沖液，使用低鹽溶液或水進(jìn)樣，使用高離子強(qiáng)度的裝填緩沖液，使用低鹽溶液或水進(jìn)樣，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)負(fù)的電導(dǎo)信號(hào)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)負(fù)的電導(dǎo)信號(hào)/倒峰（不需要平衡、節(jié)省時(shí)間等）倒峰（不需要平衡、節(jié)省時(shí)間等）柱效評(píng)價(jià)柱效評(píng)價(jià) TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHN = plates per columnVe = elution volume cm

23、 or mlW1/2 = width of the peak at half peak height cm or mlSymmetry:Distance b / a = peak width at 10% peak height cm or mlInjectionab1/10 hhhVe1/2 hW1/2N = 5.54 (Ve /W1/2 )2結(jié)果與下列因素有關(guān)結(jié)果與下列因素有關(guān):- 評(píng)價(jià)操作（因人而異）評(píng)價(jià)操作（因人而異）- 進(jìn)樣的可重復(fù)性（硬件影響）進(jìn)樣的可重復(fù)性（硬件影響） - 流速流速- 進(jìn)樣樣品的分子尺寸進(jìn)樣樣品的分子尺寸柱效與不對(duì)稱性因子的計(jì)算柱效與不對(duì)稱性因子的計(jì)算 TOSOH

24、 BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH樣品：丙酮樣品：丙酮Pall Resolute 400TOYOPEARL填料裝填柱的最小柱效值填料裝填柱的最小柱效值 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH理想的峰形理想的峰形 (Gau) 與非理想的峰形與非理想的峰形Gau 前沿前沿/前伸峰前伸峰 拖尾峰拖尾峰 柱效評(píng)價(jià)柱效評(píng)價(jià) 峰形峰形 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH前沿峰的處理前沿峰的處理 提高漿液濃度提高漿液濃度 降低裝填壓力降低裝填壓力 縮短靜置時(shí)間縮短靜置時(shí)間

25、(在柱中在柱中)拖尾峰的處理拖尾峰的處理 與前沿峰的處理方法相反與前沿峰的處理方法相反低柱效的處理低柱效的處理 去除小顆粒去除小顆粒 重新平衡膠體重新平衡膠體 改變樣品改變樣品/樣品緩沖液樣品緩沖液 檢查檢測(cè)器檢查檢測(cè)器/泵泵Pall - Resolute柱效評(píng)價(jià)柱效評(píng)價(jià) 常見問(wèn)題及處理常見問(wèn)題及處理 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHII流動(dòng)式裝填中出現(xiàn)溝槽流動(dòng)式裝填中出現(xiàn)溝槽/管路管路柱床發(fā)生塌陷柱床發(fā)生塌陷IBPG 20cm ID Column / Toyopearl DEAE-650MResolute 40cm ID Column / Toyopearl Butyl-650M2-3 cm length- not criticalChannels 5 cm length - critical !處理方法：柱子的最大耐壓為處理方法：柱子的最大耐壓為3 bar - 更換耐壓較高的柱子（如：更換耐壓較高的柱子（如： 7 bar ）