實(shí)驗(yàn)九動(dòng)物肝臟DNA提取和鑒定PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1實(shí)驗(yàn)九動(dòng)物肝臟實(shí)驗(yàn)九動(dòng)物肝臟DNA提取和鑒定提取和鑒定第1頁(yè)/共30頁(yè)（一）動(dòng)物肝臟（一）動(dòng)物肝臟DNA制備原理制備原理第2頁(yè)/共30頁(yè)第3頁(yè)/共30頁(yè)細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法機(jī)械物理法：第4頁(yè)/共30頁(yè)細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法機(jī)械物理法第5頁(yè)/共30頁(yè)第6頁(yè)/共30頁(yè)第7頁(yè)/共30頁(yè)第8頁(yè)/共30頁(yè)第9頁(yè)/共30頁(yè)（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理：l瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一種電作為支持介質(zhì)的一種電泳分離方法，是一種簡(jiǎn)便、快速分離鑒定核酸的方法，已泳分離方法，是一種簡(jiǎn)便、快速分離鑒定核酸的方法，已成為分

2、子生物學(xué)及基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。l瓊脂糖瓊脂糖英文名英文名agarose，是從是從瓊脂瓊脂中提取出來(lái)的，由中提取出來(lái)的，由半半乳糖乳糖和和L- L- 半乳糖半乳糖相互結(jié)合的相互結(jié)合的鏈狀多糖鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂瓊脂糖和瓊脂都都可在不同濃度的水溶液下可形成可在不同濃度的水溶液下可形成多孔的凝膠多孔的凝膠，電泳中具有，電泳中具有分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)。但。但瓊脂糖含硫酸根比瓊脂少瓊脂糖含硫酸根比瓊脂少，電滲作用電滲作用降低降低，因而分離效果明顯提高。，因而分離效果明顯提高。第10頁(yè)/共30頁(yè)lDNADNA分子分子在在pH高于其等電點(diǎn)的溶液中

3、帶負(fù)電荷，在電高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)（場(chǎng)中向正極移動(dòng)（電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)） 。lDNA分子泳動(dòng)速率的大小除與分子泳動(dòng)速率的大小除與DNA分子的帶電量有關(guān)分子的帶電量有關(guān)外，還與外，還與DNA分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)（瓊脂糖凝膠分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)（瓊脂糖凝膠的的分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)）。）。l電泳時(shí)，用電泳時(shí)，用溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)做前沿指示劑，用做前沿指示劑，用溴化乙啶溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示指示DNA樣品在凝膠中的確樣品在凝膠中的確切位置。切位置。l溴化乙啶溴化乙啶是一種熒光染料，可插入是一種熒光染料，可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)的

4、兩個(gè)堿基對(duì)之間，與兩個(gè)堿基對(duì)之間，與DNA分子形成絡(luò)合物，在紫外光的分子形成絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光。激發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光。第11頁(yè)/共30頁(yè)第12頁(yè)/共30頁(yè)瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的影響因素瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的影響因素第13頁(yè)/共30頁(yè)瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點(diǎn)：瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1 1）操作簡(jiǎn)單、制備容易快速、凝膠機(jī)械性能好、電泳速度）操作簡(jiǎn)單、制備容易快速、凝膠機(jī)械性能好、電泳速度快、分離快、分離DNADNA片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。（2 2）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對(duì)樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率）凝

5、膠結(jié)構(gòu)均勻，對(duì)樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。高，重復(fù)性好。（3 3）瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外）瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光檢測(cè)及定量測(cè)定。光檢測(cè)及定量測(cè)定。（4 4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。制）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保存。成干膜可長(zhǎng)期保存。因此，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研因此，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一，究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一， DNADNA樣本的分離、純化、鑒定以及樣本的分離、純化、鑒定以及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定常用瓊脂糖凝膠電

6、泳。相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定常用瓊脂糖凝膠電泳。第14頁(yè)/共30頁(yè) 熒光染料熒光染料EB染染色后，在紫外燈色后，在紫外燈(305nm)下觀下觀察到的電泳結(jié)果察到的電泳結(jié)果：第15頁(yè)/共30頁(yè) * * 熒光染料熒光染料EBEB染色的原理和優(yōu)點(diǎn)是什么？染色的原理和優(yōu)點(diǎn)是什么？ 1 1、原理：、原理： EBEB：即即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲錠溴鹽苯基菲錠溴鹽( (Ethidium Bromide)Ethidium Bromide)。 EBEB是一種扁平分子，它可以是一種扁平分子，它可以嵌入核酸的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙色嵌入核酸的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出

7、紅橙色熒光。熒光。 激發(fā)的熒光的能量來(lái)源于兩個(gè)方面：一是核酸吸激發(fā)的熒光的能量來(lái)源于兩個(gè)方面：一是核酸吸收收2 260nm60nm的紫外線后將能量傳遞給的紫外線后將能量傳遞給EBEB，二是二是EBEB本身吸本身吸收收302302nmnm和和360360nmnm的紫外線的能量。這兩方面的能量最的紫外線的能量。這兩方面的能量最終激發(fā)終激發(fā)EBEB發(fā)射波長(zhǎng)為發(fā)射波長(zhǎng)為590590nmnm的可見光（紅橙區(qū)）。的可見光（紅橙區(qū)）。第16頁(yè)/共30頁(yè) 2 2、優(yōu)點(diǎn)：、優(yōu)點(diǎn)：（1 1）染色比較簡(jiǎn)便、快捷，一般在）染色比較簡(jiǎn)便、快捷，一般在10101515minmin就可反應(yīng)。就可反應(yīng)。（2 2）EBEB對(duì)核

8、酸分子無(wú)破壞作用，這是其它染料所不能做對(duì)核酸分子無(wú)破壞作用，這是其它染料所不能做 到的。到的。（3 3）EBEB靈敏度高，可檢測(cè)出靈敏度高，可檢測(cè)出1010ngng或更少的或更少的DNADNA含量。含量。（4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的檢測(cè)。的檢測(cè)。（5 5）EBEB可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時(shí)用紫外可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時(shí)用紫外 燈檢測(cè)電泳的進(jìn)程和效果。燈檢測(cè)電泳的進(jìn)程和效果。（6 6）EB-DNAEB-DNA復(fù)合物中的復(fù)合物中的EBEB發(fā)出的熒光比游離的發(fā)出的熒光比游離的EBEB強(qiáng)強(qiáng)1010倍，倍， 因此不需洗凈凝膠中游離的因此不需

9、洗凈凝膠中游離的EBEB也可檢測(cè)出也可檢測(cè)出DNADNA的條帶。的條帶。第17頁(yè)/共30頁(yè)3 3、缺點(diǎn)：、缺點(diǎn)： 溴化乙啶是一種強(qiáng)的致突變劑，在操作和配制試劑溴化乙啶是一種強(qiáng)的致突變劑，在操作和配制試劑時(shí)應(yīng)戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，時(shí)應(yīng)戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，應(yīng)進(jìn)行處理。應(yīng)進(jìn)行處理。（1 1）每）每100100mlml溶液中加入溶液中加入100100mgmg粉狀活性炭；粉狀活性炭；（2 2）室溫下放置）室溫下放置1 1小時(shí)，不時(shí)的搖動(dòng)；小時(shí)，不時(shí)的搖動(dòng)；（3 3）用新華一號(hào)濾紙過(guò)濾，棄濾液；）用新華一號(hào)濾紙過(guò)濾，棄濾液；（4 4）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，

10、作為有害廢物處理。）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物處理。* *溴化乙啶在溴化乙啶在260260分解，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行焚化后不會(huì)有分解，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行焚化后不會(huì)有危險(xiǎn)性。危險(xiǎn)性。第18頁(yè)/共30頁(yè)第19頁(yè)/共30頁(yè)第20頁(yè)/共30頁(yè)自動(dòng)取液器的構(gòu)造自動(dòng)取液器的使用吸入液體吸入液體 排出液體排出液體使用注意事項(xiàng)：不超量程使用；不倒置；使用完畢調(diào)至最大刻度上。使用注意事項(xiàng)：不超量程使用；不倒置；使用完畢調(diào)至最大刻度上。第21頁(yè)/共30頁(yè)第22頁(yè)/共30頁(yè)第23頁(yè)/共30頁(yè)為變性蛋白凝膠。為變性蛋白凝膠。第24頁(yè)/共30頁(yè)第25頁(yè)/共30頁(yè) 8.8.凝膠板的制備：凝膠板的制備：（1 1）取瓊

11、脂糖）取瓊脂糖0.7 0.7 g g，加加1 1TBETBE緩沖溶液緩沖溶液100100mlml，于沸水浴中于沸水浴中至熔化，制成至熔化，制成0.7%0.7%的瓊脂糖膠液。的瓊脂糖膠液。（2 2）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成8 8mmmm高的擋墻，壓緊膠帶高的擋墻，壓緊膠帶，置水平臺(tái)面上。，置水平臺(tái)面上。（3 3）插入梳子，梳齒下端離板底插入梳子，梳齒下端離板底0.50.51 1mmmm。（4 4）g/mLg/mL的的EBEB溶液。溶液。（5 5）將將6060凝膠不間斷倒入膠床，高凝膠不間斷倒入膠床，高3 34 4mmmm，避免氣泡，搖避免氣泡，搖勻，室溫下凝固。勻，

12、室溫下凝固。（6 6）完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，高于膠面液，高于膠面1 12 2mmmm，從一頭輕輕斜拉出梳子，除去產(chǎn)生從一頭輕輕斜拉出梳子，除去產(chǎn)生的氣泡。的氣泡。第26頁(yè)/共30頁(yè) 9.9.加樣：加樣： 將樣品將樣品DNADNA溶液與加樣緩沖液以溶液與加樣緩沖液以5 5 ：1 1的體積比混合，用的體積比混合，用微量移液器加樣，每加完一個(gè)樣品，沖洗三次。加樣量微量移液器加樣，每加完一個(gè)樣品，沖洗三次。加樣量151520 20 l l （加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部）。透凝膠底部）。 10.10.電泳：電泳： 為了獲得電泳分離為了獲得電泳分離DNADNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于應(yīng)高于5 5V/cmV/cm（兩電極間的距離）開始時(shí)用較高電壓兩電極間的距離）開始時(shí)用較高電壓(80(80V)V)，樣品一進(jìn)入膠內(nèi)則將電壓調(diào)至樣品一進(jìn)入膠內(nèi)則將電壓調(diào)至5 5V/cm V/cm 。當(dāng)染料前沿移至當(dāng)染料前沿移至底邊底邊1-21-2mmmm時(shí)，電泳