生物大分子分離純化技術(shù)ppt課件

1、第二章第二章生物大分子分別純化技術(shù)生物大分子分別純化技術(shù)2.4. 生物大分子的色譜分別純化技術(shù)2.4.1 高效毛細管電泳高效毛細管電泳 高效毛細管電泳高效毛細管電泳(High-performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是荷電粒是荷電粒子在直流高壓的作用下，在毛細管中遷移，子在直流高壓的作用下，在毛細管中遷移，從而進展高效、快速分別的一種電泳新技術(shù)。從而進展高效、快速分別的一種電泳新技術(shù)。其分別是基于帶電離子在電場中的不同的電其分別是基于帶電離子在電場中的不同的電泳淌度。它的根本原理與常規(guī)凝膠電泳或自泳淌度。它的根本原理與常規(guī)凝膠電泳或自在電泳并無本

2、質(zhì)的差別。所以，在電泳并無本質(zhì)的差別。所以，HPCE可以可以看成是一種儀器化程度比較高的電泳方式?？闯墒且环N儀器化程度比較高的電泳方式。由于毛細管具有良好的散熱性能，從而可以在毛由于毛細管具有良好的散熱性能，從而可以在毛細管兩端加上高達細管兩端加上高達30000 V 的高壓、分別可以在很的高壓、分別可以在很短時間內(nèi)完成，分別效率非常高。這種方法所需短時間內(nèi)完成，分別效率非常高。這種方法所需樣品體積只需樣品體積只需L-nL級。所以，級。所以，HPEC法的特點法的特點為：高效、快速、微量、易于實現(xiàn)自動化，而且為：高效、快速、微量、易于實現(xiàn)自動化，而且溶劑耗費少、環(huán)境污染小等等。溶劑耗費少、環(huán)境污染

3、小等等。儀器儀器 HPCEHPCE儀器的根本組成如下圖，它由毛細管，帶儀器的根本組成如下圖，它由毛細管，帶電極的容器，高壓直流電源，進樣系統(tǒng)，檢測器及電極的容器，高壓直流電源，進樣系統(tǒng)，檢測器及數(shù)據(jù)采集和記錄系統(tǒng)組成。比較先進的數(shù)據(jù)采集和記錄系統(tǒng)組成。比較先進的HPCEHPCE儀器還儀器還配有毛細管恒溫設(shè)備，自動采樣器，微制備組分搜配有毛細管恒溫設(shè)備，自動采樣器，微制備組分搜集器和基于計算機的自動化及數(shù)據(jù)評價系統(tǒng)。集器和基于計算機的自動化及數(shù)據(jù)評價系統(tǒng)。 1毛細管毛細管 H P C E 在 毛 細 管 中 進 展 ， 管 內(nèi) 徑 普 通 在在 毛 細 管 中 進 展 ， 管 內(nèi) 徑 普 通 在

4、25100m之間，外徑在之間，外徑在100400m之間長度之間長度為為0.11m。除了石英毛細管外，玻璃、聚四氟乙烯。除了石英毛細管外，玻璃、聚四氟乙烯(PTPE)及聚氟乙烯及聚氟乙烯-丙烯毛細管也有運用。丙烯毛細管也有運用。 2 2進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng) 為了保證為了保證HPCEHPCE分別的高效性，進樣系統(tǒng)應(yīng)盡量分別的高效性，進樣系統(tǒng)應(yīng)盡量把把nL-pLnL-pL級的樣品以最短的樣品區(qū)帶引入到毛細管級的樣品以最短的樣品區(qū)帶引入到毛細管中。中。 普通可采用電動法或流膂力學(xué)法。普通可采用電動法或流膂力學(xué)法。 3高壓直流電源高壓直流電源 高壓電源需提供高達高壓電源需提供高達30 kV的直流電壓。檢測的

5、直流電壓。檢測器位于毛細管的接地端，電流在器位于毛細管的接地端，電流在3300 A之間。之間。電源應(yīng)能以恒電壓或恒電流電源應(yīng)能以恒電壓或恒電流(ITP)或恒功率的方式或恒功率的方式任務(wù)，其穩(wěn)定件應(yīng)到達設(shè)置值的任務(wù)，其穩(wěn)定件應(yīng)到達設(shè)置值的0.1%。另外，。另外，電源的正負極應(yīng)可以切換，以順應(yīng)帶不同電荷的電源的正負極應(yīng)可以切換，以順應(yīng)帶不同電荷的樣品的分別。樣品的分別。 4 4檢測檢測 HPECHPEC這種方法的靈敏度及高效性都依賴于檢測這種方法的靈敏度及高效性都依賴于檢測器的高靈敏度，實踐曾經(jīng)采用的檢測器類型有多種。器的高靈敏度，實踐曾經(jīng)采用的檢測器類型有多種。HPEC中的主要檢測技術(shù)中的主要檢

6、測技術(shù)檢測原理檢測原理 最低檢出濃度最低檢出濃度(mol/L) 最低檢最低檢出量出量 適用范圍適用范圍紫外可見吸收法紫外可見吸收法 10-610-4 10-1510-13 通用通用/特殊情況特殊情況基于普通光源的熒光法基于普通光源的熒光法 10-810-5 10-1810-13 特殊情況特殊情況基于激光的熒光法基于激光的熒光法 10-1210-9 10-2110-18 特殊情況特殊情況熱光吸收法熱光吸收法 10-810-5 10-1710-14 通用通用/特殊情況特殊情況折射率法折射率法 10-710-5 10-1610-14 通用通用電導(dǎo)法電導(dǎo)法 10-810-6 10-1910-17 特殊

7、情況特殊情況安培法安培法 10-810-6 10-1910-17 特殊情況特殊情況質(zhì)譜法質(zhì)譜法 10-910-5 10-1710-15 通用通用放射測定法放射測定法 10-910-7 10-1910-17 特殊情況特殊情況分別方式分別方式 HPCE的操作方式有多種，如毛細管區(qū)帶電泳的操作方式有多種，如毛細管區(qū)帶電泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)；毛細管；毛細管等速電泳等速電泳(Capillary Isotachophoresis，CITP)，毛細管膠束電動色譜毛細管膠束電動色譜(Capillary Micellar Electrokinetic Ch

8、romatography，CEKC)；毛細；毛細管凝膠電泳管凝膠電泳(Capillary Gel Electrophoresis，CGE)和毛細管等電聚焦法和毛細管等電聚焦法(Capillary Isoelectric Focusing，CIEF)等。等。 CZE CZE是基于溶質(zhì)在自在溶液中淌度差別的電泳是基于溶質(zhì)在自在溶液中淌度差別的電泳分別方法，是目前運用最廣泛的一種，如氨基分別方法，是目前運用最廣泛的一種，如氨基酸、多肽及無機離子的分析，手性對映體分別，酸、多肽及無機離子的分析，手性對映體分別，蛋白質(zhì)純度鑒定及構(gòu)型研討等。蛋白質(zhì)純度鑒定及構(gòu)型研討等。 CGE主要在生物學(xué)上用于大分子的分

9、別分析，如主要在生物學(xué)上用于大分子的分別分析，如蛋白質(zhì)和核酸。它是基于分子的尺寸，讓樣品在蛋白質(zhì)和核酸。它是基于分子的尺寸，讓樣品在適宜的起分子篩作用的聚合物網(wǎng)孔內(nèi)進展電泳分適宜的起分子篩作用的聚合物網(wǎng)孔內(nèi)進展電泳分別。別。CGE可用于可用于DNA序列分析，蛋白質(zhì)分析。序列分析，蛋白質(zhì)分析。pBR332 DNA的的MSPI酶解片段混合物的酶解片段混合物的CGE分別分別(峰峰(bP)：1，26；2，34；3, 67；4, 76；5, 90；6, 110；7, 123；8、 9, 147, 10, 11，160；12，180；13，190；14，201；15，2I7；16，238；17，242。緩

10、沖液：。緩沖液：TEB。進樣：。進樣：3s，30 mW。 TEB組成：組成：89 mmol/L Tris, 89mmol/L 硼酸鹽及硼酸鹽及2 mmol/L EDTA)。200V/cm，毛細管有效長度：，毛細管有效長度：7cm，EB的濃度為的濃度為1g/ml規(guī)范蛋白質(zhì)的分別2.4.2 2.4.2 液相色譜法液相色譜法 液相色譜是目前對生物大分子的分別純化才干最液相色譜是目前對生物大分子的分別純化才干最強、效率最高、運用最廣泛的手段之一。液相色強、效率最高、運用最廣泛的手段之一。液相色譜大都在室溫下操作，所用流動相可以用與生理譜大都在室溫下操作，所用流動相可以用與生理液相近的緩沖水溶液。所用固

11、定相的外表經(jīng)過化液相近的緩沖水溶液。所用固定相的外表經(jīng)過化學(xué)修飾和覆蓋，為生物大分子的分別分析提供了學(xué)修飾和覆蓋，為生物大分子的分別分析提供了溫暖的條件，有利于堅持生物大分子的構(gòu)象和活溫暖的條件，有利于堅持生物大分子的構(gòu)象和活性。性。 在生物大分子分別分析及純化中最常用的色譜方在生物大分子分別分析及純化中最常用的色譜方法是空間排阻色譜法、離子交換色譜法、反相色法是空間排阻色譜法、離子交換色譜法、反相色譜法、疏水作用色譜法、親和色譜法、羥基磷灰譜法、疏水作用色譜法、親和色譜法、羥基磷灰石石(用于單鏈和雙鏈用于單鏈和雙鏈DNA的純化和鑒定的純化和鑒定)及液及液液液分配色譜法。分配色譜法。核酸的色譜

12、分別法核酸的色譜分別法酶及蛋白質(zhì)的各種分別純化方法的比較酶及蛋白質(zhì)的各種分別純化方法的比較1 排阻色譜 排阻色譜(Size Exclusion Chromatography, SEC)也被稱之為凝膠過濾色譜是20世紀60年代開展起來的一種特別適宜于生物大分子分別和純化的技術(shù)。根本原理根本原理 排阻色譜是根據(jù)分別樣品物質(zhì)分子大小而進展分排阻色譜是根據(jù)分別樣品物質(zhì)分子大小而進展分別的一種方法，其固定相由一種惰性的凝膠顆粒構(gòu)別的一種方法，其固定相由一種惰性的凝膠顆粒構(gòu)成，顆粒內(nèi)部有許多網(wǎng)孔。顆粒和網(wǎng)孔的大小都可成，顆粒內(nèi)部有許多網(wǎng)孔。顆粒和網(wǎng)孔的大小都可以人為地去控制和選擇。在分別過程中，比網(wǎng)孔大以

13、人為地去控制和選擇。在分別過程中，比網(wǎng)孔大的分子不能進入網(wǎng)孔的內(nèi)部，它們只限于在凝膠顆的分子不能進入網(wǎng)孔的內(nèi)部，它們只限于在凝膠顆粒之間的流動相空間里向下流動，其流程短流動粒之間的流動相空間里向下流動，其流程短流動速度快，而比網(wǎng)孔小的分子能分散到網(wǎng)孔的內(nèi)部，速度快，而比網(wǎng)孔小的分子能分散到網(wǎng)孔的內(nèi)部，因此向下挪動時所閱歷的流程長，下行速度慢。最因此向下挪動時所閱歷的流程長，下行速度慢。最終所產(chǎn)生的結(jié)果是：分子越大挪動的越快，從而到終所產(chǎn)生的結(jié)果是：分子越大挪動的越快，從而到達大小不同分子間的分別。達大小不同分子間的分別。凝膠色譜的物理特性凝膠色譜的物理特性 1凝膠顆粒的大小和外形凝膠顆粒的大小

14、和外形 層析用凝膠的外形均為球形，內(nèi)部具有高密度層析用凝膠的外形均為球形，內(nèi)部具有高密度網(wǎng)孔，并能構(gòu)成均一的柱床。網(wǎng)孔，并能構(gòu)成均一的柱床。 2排阻極限排阻極限(Exclusion Limit) 排阻極限指不能分散進入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)部的排阻極限指不能分散進入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)部的最小溶質(zhì)分子的分子量大小。排阻極限的涵義是最小溶質(zhì)分子的分子量大小。排阻極限的涵義是能有效分別一定外形分子的分子量最大極限。大能有效分別一定外形分子的分子量最大極限。大于這一極限的一切分子，都在同一區(qū)帶內(nèi)被快速于這一極限的一切分子，都在同一區(qū)帶內(nèi)被快速洗脫出。典型的葡聚糖凝膠洗脫出。典型的葡聚糖凝膠Sephadex G-5

15、0(G50)排阻極限為排阻極限為3.0104 3分級分別范圍分級分別范圍(Fractionation Range) 該物理性質(zhì)表示某種凝膠允許溶質(zhì)分子量在該物理性質(zhì)表示某種凝膠允許溶質(zhì)分子量在多大范圍內(nèi)能得到線性分別。多大范圍內(nèi)能得到線性分別。如上所述的如上所述的G50的分級分別范圍為的分級分別范圍為1.51033.0104。4. 得水率得水率(Water Regain, Wr) 每每1g干凝膠吸收水的克數(shù)就叫得水率。對干凝膠吸收水的克數(shù)就叫得水率。對G50凝膠，其得水率為凝膠，其得水率為5.00.38，這個數(shù)值只表示吸，這個數(shù)值只表示吸進凝膠顆粒內(nèi)部的水分，不包括凝膠周圍的水分。進凝膠顆粒內(nèi)

16、部的水分，不包括凝膠周圍的水分。5床體積床體積(Bed Volume)每每1g干凝膠吸水膨化后的最后體積就叫床體積。干凝膠吸水膨化后的最后體積就叫床體積。6外水體積外水體積(Void Volume, V0)凝膠裝柱以后，凝膠周圍一切空間的總體積就叫外凝膠裝柱以后，凝膠周圍一切空間的總體積就叫外水體積。水體積。7洗脫體積洗脫體積(Elution Volume, Vc )指從柱床上將樣品中某一物質(zhì)洗脫下來所需洗脫液指從柱床上將樣品中某一物質(zhì)洗脫下來所需洗脫液的總體積。的總體積。 在凝膠層析中，最常用的四種凝膠是：葡聚在凝膠層析中，最常用的四種凝膠是：葡聚糖 凝 膠糖 凝 膠 ( D e x t r

17、 a n ) 、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠(Polyacrylamine)、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖凝膠(Agarose)以及以及后兩者的復(fù)合凝膠。后兩者的復(fù)合凝膠。凝膠排阻層析的運用凝膠排阻層析的運用 凝膠排阻層折的用途非常多，主要有以下兩個凝膠排阻層折的用途非常多，主要有以下兩個方面：方面： (1)脫鹽脫鹽 在生物大分子純化過程中，常要除去在生物大分子純化過程中，常要除去無機鹽、有機溶劑及其它小分子雜質(zhì)，利用凝膠無機鹽、有機溶劑及其它小分子雜質(zhì)，利用凝膠排阻分別是一種廉價、簡便又快速的方法；排阻分別是一種廉價、簡便又快速的方法； (2)生物大分子純化生物大分子純化

18、 凝膠層析運用最為廣泛的凝膠層析運用最為廣泛的一個方面是生物大分子的分別和純化，由于凝膠一個方面是生物大分子的分別和純化，由于凝膠具有根據(jù)分子量的大小而分級分別生物大分子的具有根據(jù)分子量的大小而分級分別生物大分子的才干。才干。2 親和層析親和層析(Affinity Chromatography)常規(guī)層析的缺乏常規(guī)層析的缺乏 大多數(shù)層析法都是根據(jù)樣品物質(zhì)和固定相之間大多數(shù)層析法都是根據(jù)樣品物質(zhì)和固定相之間的非特異性相互作用，如根據(jù)樣品物質(zhì)的電荷性質(zhì)、的非特異性相互作用，如根據(jù)樣品物質(zhì)的電荷性質(zhì)、大小、極性、分配系數(shù)、吸附等作用的差別進展分大小、極性、分配系數(shù)、吸附等作用的差別進展分別的。由于選擇

19、性不夠強，故分別效率不高。別的。由于選擇性不夠強，故分別效率不高。 近年來又開展了一種新的層析法近年來又開展了一種新的層析法“親和層親和層析法，又稱析法，又稱特異配基層析法。特異配基層析法。 一些生物大分子能和高分子化合物發(fā)生特異一些生物大分子能和高分子化合物發(fā)生特異性的化學(xué)反響，這些反響是可逆的、特異的。性的化學(xué)反響，這些反響是可逆的、特異的。根據(jù)這一性質(zhì)所進展的分別就叫親和層析。與根據(jù)這一性質(zhì)所進展的分別就叫親和層析。與生物大分子可逆而又特異性結(jié)合的分子就叫配生物大分子可逆而又特異性結(jié)合的分子就叫配基?；?。根本原理根本原理 親和層析的原理可用一個親和對來闡明。如生親和層析的原理可用一個親和

20、對來闡明。如生物大分子抗體可以與其對應(yīng)的抗原發(fā)生如上所述的物大分子抗體可以與其對應(yīng)的抗原發(fā)生如上所述的親和作用。假設(shè)把抗原固定在類似于凝膠的固相載親和作用。假設(shè)把抗原固定在類似于凝膠的固相載體上得到親和固定相，在進展層析分別時，抗體與體上得到親和固定相，在進展層析分別時，抗體與抗原間發(fā)生特異性的親和作用，而其他的物質(zhì)不能抗原間發(fā)生特異性的親和作用，而其他的物質(zhì)不能與固定相結(jié)合。因此被洗脫出。然后用一種特殊的與固定相結(jié)合。因此被洗脫出。然后用一種特殊的洗脫劑把抗體從親和柱上洗脫下來也可以固相抗洗脫劑把抗體從親和柱上洗脫下來也可以固相抗體來提純、分別抗原。親和層析已被廣泛地用于酶體來提純、分別抗原

21、。親和層析已被廣泛地用于酶類、運輸?shù)鞍住⒖贵w、激素受體蛋白、藥物結(jié)合蛋類、運輸?shù)鞍?、抗體、激素受體蛋白、藥物結(jié)合蛋白、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)蛋白以及其它生物大分子物質(zhì)白、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)蛋白以及其它生物大分子物質(zhì)的分別分析。的分別分析?？贵w親和層析純化表示圖抗體親和層析純化表示圖 親和層析的成敗取決于精細的實驗條件的選親和層析的成敗取決于精細的實驗條件的選擇，其中最主要的是制備帶有共價結(jié)合配基的擇，其中最主要的是制備帶有共價結(jié)合配基的固定相以及洗脫條件的優(yōu)化。固定相以及洗脫條件的優(yōu)化。親和層析的固定相載體必需符合以下要求親和層析的固定相載體必需符合以下要求(1)在實驗條件下具有化學(xué)及物理穩(wěn)定性在實驗條件

22、下具有化學(xué)及物理穩(wěn)定性(2)非特異性吸附要盡能夠?。环翘禺愋晕揭M能夠??；(3)具有均勻的網(wǎng)狀空隙構(gòu)造；具有均勻的網(wǎng)狀空隙構(gòu)造；(4)具有和配基結(jié)合的活性基團。具有和配基結(jié)合的活性基團。親和色譜的運用親和色譜的運用 基于羥基磷灰石固定相的親和色譜可用于單鏈和基于羥基磷灰石固定相的親和色譜可用于單鏈和雙鏈雙鏈DNA的純化和鑒定。的純化和鑒定。DNA與羥基磷灰石的相與羥基磷灰石的相互作用基于互作用基于DNA磷酸酯骨架與羥基磷灰石中的鈣離磷酸酯骨架與羥基磷灰石中的鈣離子間的相互作用。洗脫時用磷酸緩沖液，核酸分子子間的相互作用。洗脫時用磷酸緩沖液，核酸分子的親和性受其分子中磷酸基團的控制。單鏈的親和

23、性受其分子中磷酸基團的控制。單鏈DNA分分子的構(gòu)造可變無序，它與剛性有序的雙鏈子的構(gòu)造可變無序，它與剛性有序的雙鏈DNA分子分子相比，其親和性要小。雜交的雙鏈相比，其親和性要小。雜交的雙鏈DNA及部分變性及部分變性的的DNA分子的親和性適中。因此，單鏈分子的親和性適中。因此，單鏈DNA分子分子的結(jié)合弱，結(jié)合的雙鏈的結(jié)合弱，結(jié)合的雙鏈DNA分子可以經(jīng)過添加磷酸分子可以經(jīng)過添加磷酸洗脫緩沖液的濃度使之解離。洗脫緩沖液的濃度使之解離。3 離子交換色譜離子交換色譜 離子交換色譜離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography, IEC)是生物大分子分級分別的最可靠的方法之是生物大分

24、子分級分別的最可靠的方法之一，它分別蛋白質(zhì)、核酸等是根據(jù)生物大分子的一，它分別蛋白質(zhì)、核酸等是根據(jù)生物大分子的電荷特性，因此依賴于系統(tǒng)的電荷特性，因此依賴于系統(tǒng)的pH及分別物質(zhì)的及分別物質(zhì)的等電點等電點(pI)。當緩沖溶液的。當緩沖溶液的pH高于生物分子的高于生物分子的pI時，應(yīng)采用陰離子交換樹脂，反之，應(yīng)采用陽離時，應(yīng)采用陰離子交換樹脂，反之，應(yīng)采用陽離子交換樹脂。子交換樹脂。 生物大分子非常小的電荷差別都可以用生物大分子非常小的電荷差別都可以用IEC法法別分開。別分開。4 反相疏水作用色譜法反相疏水作用色譜法 反相色譜反相色譜(Reverse-phase Chromatography, R

25、PC)及疏水作用色譜及疏水作用色譜(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)法根據(jù)的是生物大分子外表法根據(jù)的是生物大分子外表疏水性。疏水性。 反相色譜是基于溶質(zhì)、極性流動相和非極性固定反相色譜是基于溶質(zhì)、極性流動相和非極性固定相外表之間的疏水作用建立的一種色譜方式。而疏相外表之間的疏水作用建立的一種色譜方式。而疏水作用色譜與反相色譜的原理一樣，只是填料外表水作用色譜與反相色譜的原理一樣，只是填料外表疏水性弱一些。疏水性弱一些。 蛋白質(zhì)及多肽的疏水基因普通包埋在分子的內(nèi)蛋白質(zhì)及多肽的疏水基因普通包埋在分子的內(nèi)部許多生物大分子雖然是親水性的，但它們也有足部許多生物大分子雖然是親水性的，但它們也有足夠多的疏水基團暴露在分子的外表，因此可以與載體夠多的疏水基團暴露在分子的外表，因此可以與載體外表的疏水基團發(fā)生相互作用。在上述兩種技術(shù)中固外表的疏水基團發(fā)生相互作用。在上述兩種技術(shù)中固定相都由具有疏水外表的色譜基質(zhì)所組成