加味補肝湯對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中蛋白激酶Cβ亞型表達的影響

1、加味補肝湯對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中蛋白激酶C亞型表達的影響 作者：傅擎宇,黃娟,陳澤奇,熊麗麗【摘要】 目的 觀察加味補肝湯對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中蛋白激酶C亞型(PKC-)mRNA表達的影響,探討其對實驗性糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的防治作用。方法 65只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機取20只為正常組,45只造模,以鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病模型,將造模成功后的40只大鼠隨機分為模型組、加味補肝湯組。分別于治療后4、8周處死大鼠,用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)測定坐骨神經(jīng)中PKC- mRNA的表達。結(jié)果 治療后4、8周模型組大鼠PKC- mRNA表達明顯高于正常對照組(P0.05),加味補肝湯組P

2、KC- mRNA表達明顯低于同期模型組(P0.05)。結(jié)論 加味補肝湯對實驗性糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變有一定的防治作用。 【關(guān)鍵詞】 加味補肝湯；糖尿??；坐骨神經(jīng)；蛋白激酶C亞型；大鼠 Abstract：Objective To observe the effect of Jiawei Bugan decoction on PKC- expression of sciatic nerve in experimental diabetic rat and explore its preventive and therapeutic effects on peripheral neuropathy

3、in experimental diabetic rats. Methods In 65 rats involved, 45 rats were made as model and 20 were used as control. The diabetic rat model was established by streptozotocin (STZ). Forty model rats were randomly divided into model group and Jiawei Bugan decoction group. The rats were killed on 4th or

4、 8th week from the beginning of treatment respectively, and PKC-2 / 18 mRNA of sciatic nerve was detected by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Results PKC- expression of the model group on 4th or 8th week was higher than that of the normal control group (P0.05), while that of

5、 Jiawei Bugan decoction group were markedly lower than the model group (P0.05). Conclusion Jiawei Bugan decoction has preventive and therapeutic effect on peripheral neuropathy in experimental diabetic rats. Key words：Jiawei Bugan decoction；diabetes；sciatic nerve；protein kinase c-；rat 糖尿病周圍神經(jīng)病變(DNP)

6、是目前糖尿病患者致殘的主要原因。大量研究表明,蛋白激酶C信號傳導(dǎo)通路與糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)生相關(guān),尤其與蛋白激酶C亞型(PKC-)關(guān)系更為密切1。目前已闡明,該通路在糖尿病視網(wǎng)膜病變及腎病發(fā)展中起重要作用2,但糖尿病神經(jīng)組織中的情況仍存在爭議。為此,筆者觀察了PKC-在實驗性糖尿病大鼠2個月坐骨神經(jīng)的表達變化情況及中藥湯劑加味補肝湯對其的影響,探討其對實驗性糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的防治作用。1 實驗材料1.1 動物 8周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠65只,體重250280 g,上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,許可證號SCXK(滬) 2003-003。1.2 藥物 加味補肝湯(枸杞子15

7、 g,木瓜15 g,當歸10 g,川芎10 g,熟地黃12 g,白芍15 g,桑寄生15 g,麥冬15 g,花粉15 g),中藥飲片由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科提供。中藥飲片加水300 mL,浸泡30 min,水煎40 min,第2次煎時加水200 mL,煎煮20 min,取煎汁,混勻,水浴濃縮成每1 mL含2.72 g原藥材的藥液。1.3 儀器 TC-512型PCR儀(英國TECHNE公司)；血糖儀(德國羅氏公司ACCU-CHEK)；Motic2000圖像分析儀；MS302多媒體生物信號記錄分析系統(tǒng)(廣州中醫(yī)藥大學(xué))。1.4 試劑 瓊脂糖(北京鼎國公司)；溴化乙錠、鏈脲佐菌素(美國Sigma公司

8、)；Trizol(MRC公司)；反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(美國MRI公司)；Pre Mix Taq(寶生物大連有限公司)；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；其他常規(guī)試劑由湘雅醫(yī)院藥劑科提供。2 實驗方法2.1 分組 65只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機取20只為正常組,45只造模,將造模成功后的40只大鼠隨機分為模型組20只,加味補肝湯實驗組20只。2組血糖值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.2 造模及給藥 參照文獻3方法。造模前禁食12 h,一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(50 mg/kg,0.1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制而成,pH4.24.5)誘發(fā)糖尿病,72 h后用血糖儀測定尾

9、尖血血糖,凡血糖16.7 mmol/L為造模成功,造模不成功的大鼠按上述方法重復(fù)1次。正常組20只大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射相等容積0.1 mol/L的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。2.3 血糖測定 尾靜脈取血,采用葡萄糖氧化酶法,羅氏公司ACCU-CHEK血糖儀及試紙條測定。2.4 神經(jīng)電生理檢測 參照文獻4方法并略加改進,分別于治療后4、8周末進行神經(jīng)電生理檢測。大鼠一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg),麻醉后俯臥固定,刺激電極置于坐骨切跡(刺激強度2.0 mV,刺激波寬3.0 ms),在踝部(遠端)和右足二趾間分別插入記錄電極,參考電極置于記錄電極和刺激電極之間,并連接計算

10、機MS302多媒體生物信號記錄分析系統(tǒng),記錄遠近端坐骨神經(jīng)產(chǎn)生動作電位的潛伏期,測定兩記錄電極間的距離,神經(jīng)傳導(dǎo)速度為記錄電極之間的距離/動作電位潛伏期之差。測定時保持被檢測肢體溫度在37 左右。2.5 標本收集 分別于治療后4、8周一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,俯臥位固定,取左側(cè)梨狀肌下緣坐骨神經(jīng)約1 cm,置于液氮中,-80 保存,用于mRNA檢測。2.6 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 引物合成：用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(見表1)。表1 目的基因擴增引物序列（略） 組織總RNA提?。翰捎肨rizol提取總RNA。按

11、Trizol試劑說明書提取總RNA,溶解于20 L DEPC處理滅菌雙蒸水,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,并測定A260/A280比值在1.82.0之間,說明RNA樣品純度理想；于-70 凍存。 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作：總RNA 2 L(約0.5 g),Oligo(dT) l8(50 g/mL)1 L,RNasin 1 L,加EDPC水至11 L,70 , 5 min；冰上驟冷30 s,加5×Rtbuffer 4 L,10 mmol/L dNTPMix 2 L,RNasin 1 L,加EDPC水至19 L,37 ,

12、5 min；加M-Mulv反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/L)1 L,總體積20 L,42 ,60 min；70 , 10 min。 PCR反應(yīng)體系：cDNA產(chǎn)物2 L,Pre Mix Taq 12.5 L, 10 mol/L目的引物1 L,-actin引物1 L,加DEPC水至25 L,4 000 r/min短暫離心,于PCR儀擴增。擴增反應(yīng)：94 預(yù)變性5 min,94 變性40 s,56.2 退火40 s,72 延伸45 s,32個循環(huán),最后72 延伸7 min。 產(chǎn)物分析：取5 L反應(yīng)產(chǎn)物,2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,Eagle Eye圖像處理系統(tǒng)拍照。 用Bandleader Ver3.

13、0軟件將PKC-擴增產(chǎn)物的光密度值與-actin擴增產(chǎn)物光密度值的比值作為表達水平的參數(shù),進行半定量分析。3 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料以x±s表示,采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用方差分析,如方差齊用LSD法,方差不齊則用Dunnett T3法。4 結(jié)果4.1 一般情況 實驗過程中,模型組大鼠死亡4只,加味補肝湯組死亡3只,均在補充實驗中補齊到20只。 連續(xù)給藥后,模型組在鏈脲佐菌素注射72 h后逐漸出現(xiàn)多尿、多飲、多食、毛豎無光澤、蜷臥拱背等癥狀；加味補肝湯組也有類似表現(xiàn),但程度較模型組輕。4.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的測定(見表2) 表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較(

14、略)注：與同期正常組比較,*P0.05；與同期模型組比較,#P0.05；與同組前一個時間點比較,P0.05(下同)4.3 各組大鼠坐骨神經(jīng)中蛋白激酶C亞型mRNA的表達 各組RT-PCR電泳結(jié)果顯示：模型組治療4、8周時,PKC- mRNA表達(PKC-mRNA/-actin mRNA相對吸光度值比)顯著增加,隨病程延長PKC- mRNA含量進一步增加,加味補肝湯干預(yù)后PKC- mRNA表達水平均明顯低于同期模型組(P0.05),但明顯高于正常組(P0.05)。提示加味補肝湯對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)PKC- mRNA表達有下調(diào)作用。見表3及圖1、圖2。 表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)中PKC- mRNA含

15、量半定量的比較(略)5 討論 PKC-是經(jīng)典PKC家族亞型之一,激活時需要依賴Ca2+、二?；视?DG)和磷脂酰絲氨酸(PS)或佛波酯(PMA),已有研究顯示,高血糖可激活腎臟PKC、,且優(yōu)先激活PKC-。另有研究報道,實驗性糖尿病大鼠模型心臟和主動脈PKC-特異性升高5。用免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn),在糖尿病大鼠主動脈及心臟組織中及與高糖培養(yǎng)的主動脈平滑肌細胞中PKC-、亞型優(yōu)先被激活6。PKC-亞型參與了糖尿病視網(wǎng)膜、主動脈、心臟、腎臟病變的發(fā)生發(fā)展,在糖尿病微血管并發(fā)癥中已顯示了極其重要的地位。同樣,PKC信號傳導(dǎo)通路對糖尿病微血管病變之一的糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生具有重要意義。PKC豐富存在于中

16、樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的傳入、傳出神經(jīng),參與許多生理活動如神經(jīng)遞質(zhì)釋放、細胞增殖分化等,它是許多外在刺激因子如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長因子等發(fā)揮作用的重要信號調(diào)節(jié)因子7-8。本實驗觀察到,正常Wistar大鼠的坐骨神經(jīng)中PKC- mRNA僅少量表達,而模型對照4、8周時,PKC- mRNA表達出現(xiàn)顯著增加,隨病程延長PKC- mRNA含量進一步增加。PKC-表達上調(diào)可影響一系列血管功能,包括血管舒縮反應(yīng)、血管通透性、內(nèi)皮細胞生長增殖、新生血管形成以及血液流變學(xué)等,并影響細胞外基質(zhì)蛋白(ECM)變化,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-)基因表達等,這些生物效應(yīng)均參與了糖尿病神經(jīng)

17、病變的發(fā)病過程。而加味補肝湯干預(yù)后, PKC- mRNA表達水平均明顯低于模型組(P0.05),提示加味補肝湯能抑制糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)PKC- mRNA的過度表達,從而起到保護周圍神經(jīng)作用。 加味補肝湯出自醫(yī)宗金鑒一書,是滋養(yǎng)肝血的代表方劑。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究表明,具有改善血液流變性及微循環(huán)作用,從而起到改善缺血缺氧狀態(tài)。根據(jù)本實驗研究結(jié)合現(xiàn)代方劑、藥理研究推測,加味補肝湯通過有效抑制PKC-的激活和表達上調(diào),改善了PKC信號傳導(dǎo)通路對周圍神經(jīng)的不良影響,從而對糖尿病周圍神經(jīng)病變起到有效的防治作用?！緟⒖嘉墨I】 1 朱邦豪,關(guān)永源.糖尿病合并癥與蛋白激酶CJ.中國藥理學(xué)報,2000, 16(1)：

18、6.2 Nakamura J, Kato K, Hamada Y, et al. A protein kinase c-Beta- selective inhibitor ameliorates neural dysfunction in streptozotocin- induced diabetic ratsJ. Diabetes,1999,48(10)：2090.3 Schmeichel AM, Schmelzer JD, Low PA. Oxidative injury and apoptosis of dorsal root ganglion neurons in chronic e

19、xperimental diabetic neuropathyJ. Diabetes,2003,52(1)：165171.4 Yagihashi S, Kamijo M, Ido Y, et al. Effects of long-term aldose reductase inhibition on development of experimental diabetic neuropathy：ultrastructural and morphometric studies of sural nerve in streptozotocin-induced diabetic ratJ. Diabetes,1990, 39：690696.5 Inoguchi T, Battan R, Handler E, et al. Preferential elevation of protein kinase C isoform and diacyglycerol levels in the aorta and heart of diabetic rats：Differential reversibility to glycemic control by islet cell transplantationJ. Proc Natl Acad Sci US