分子熒光法測定維生素B2的含量

1、【實驗項目】分子熒光法定量測定維生素 B2 的含量【實驗目的】1. 掌握標準曲線法定量分析維生素 B2 的基本原理。2. 了解熒光分光光度計的基本原理、結構及性能，掌握其基本操作。【 實驗原理 】熒光是光致發(fā)光。任何熒光物質都具有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 , 發(fā)射波長總是 大于激發(fā)波長。熒光激發(fā)光譜是通過測定熒光體的發(fā)光通量隨波長變化而獲得的 光譜，反映不同波長激發(fā)光引起熒光的相對效率。熒光發(fā)射光譜是當熒光物質在 固定的激發(fā)光源照射后所產生的分子熒光，是熒光強度對發(fā)射波長的關系曲線， 表示在所發(fā)射的熒光中各種波長相對強度。由于各種不同的熒光物質有它們各自 特定的熒光發(fā)射波長，可用它來鑒定熒光物質。有

2、些發(fā)熒光的物質其熒光強度與 物質的濃度成正比，故可用熒光分光光度法測定其含量。維生素B2溶液在430440nm藍光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在 535nm 附近。維生素B2在pH67的溶液中熒光強度最大，而且其熒光強度與維生素B2 溶液濃度呈線性關系，因此可以用熒光光譜法測維生素B2的含量。維生素B2在堿性溶液中經光線照射會發(fā)生分解而轉化為另一物質光黃素，光黃素也是一 個能發(fā)熒光的物質，其熒光比維生素B2的熒光強得多，故測維生素 B2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內，且在避光條件下進行。在稀溶液中，熒光強度F與物質的濃度c有以下關系：F= 2.303 I0 & be當實驗條件一定時，

3、熒光強度與熒光物質的濃度呈線性關系：F=Kc【儀器與試劑 】1. 儀器： 熒光分光光度計（型號： F2500 HITAH）；1cm 石英比色皿；50mL容量瓶2. 試劑：維生素B2標準溶液（10.0卩g/mL）（已加乙酸）【實驗內容與步驟】1. 系列標準溶液和待測溶液的配制取維生素 B2（ 10.0 卩 g/mL）標準溶液 1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 分別置于50mL的容量瓶中，標定，搖勻。取2.00mL待測溶液于50mL的容量瓶中， 標定，搖勻。2. 激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的繪制（用 3.00mLd的標準溶液）設置入Em=520nr為發(fā)射波長，在25

4、0400范圍內掃描，記錄發(fā)射波長強度和 激發(fā)波長的關系曲線，便得到激發(fā)光譜。記錄最大激發(fā)波長設置入Ex為最大激發(fā)波長即371 nm在400600nm范圍內掃描，記錄發(fā)射強 度與發(fā)射波長間的函數關系，便得到熒光發(fā)射光譜從熒光發(fā)射光譜上找出其最大 的發(fā)射波長入Em和熒光強度。3. 標準溶液及樣品的熒光測定將激發(fā)波長固定在371 nm熒光發(fā)射波長為521 nm測量上述系列標準溶液的 熒光發(fā)射強度，按濃度從從低到高測定。在同樣條件下測定未知溶液的熒光強度，并由標準曲線確定未知試樣中維生素B2的濃度?！緦嶒灁祿?. 激發(fā)波長入Ex=371 nm熒光發(fā)射波長入Em=521 nm2. 標準溶液劑待測溶液的

5、濃度和熒光強度記錄維生素B2溶液濃度（卩g/mL）0.20.40.60.81.0待測溶液相對熒光強度26.7051.7675.3598. 81121.050.38可得待測溶液的濃度為0.393卩g/mL.【實驗圖像】1. 以入Em=52（為發(fā)射波長，溶液濃度為0.6卩g/mL,在250400nm范圍掃描得到的熒光強度和激發(fā)波長的關系曲線3. 設置激發(fā)波長為371 nm溶液濃度為0.6卩g/mL, 在 400600nm范圍內掃描,所得發(fā)射強度與發(fā)射波長間的熒光發(fā)射光譜如下：Sial rwJ叫EI1血0訕12應5Z1D3HD73OT5DQCFEBE-3. 以激發(fā)波長入Ex=371 nm 熒光發(fā)射波

6、長入Em=521 nm測量系列標準溶液濃度, 以標準溶液的熒光發(fā)射強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，制作標準曲線如 下：【結果分析與討論】1. 石英皿是四面透光的，拿的時候不能接觸到四個透光面，只能拿上下角部，擦 外壁殘留液時由于擦鏡紙不吸水，故可先用吸水紙巾擦干，再用擦鏡紙擦。2. 本次實驗所得到的R值為0.99977，而理論R值為1,相關度很接近，說明準確 度比較高，溶液配制比較準確。3. 配制好的溶液應盡快測量，避免久置成分變化而影響結果。4. 干擾熒光分光分光度法的因素：(1) 溶劑：同一熒光物質在不同的溶劑中可能表現出不同的熒光性質。溶劑的極性 增強，對激發(fā)態(tài)會產生更大的穩(wěn)定作用，

7、結果使物質的熒光波長紅移，熒光強 度增大。(2) 溫度：升高溫度會使非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。(3) PH :大多數含有酸性或堿性取代基團的芳香族化合物的熒光性質受PH的影響很大。(4) 溶液表面活性劑的存在，減少非輻射躍遷的概率，提高了熒光效率。(5) 溶液中溶解氧的存在，由于氧分子的順磁性質，使激發(fā)單重態(tài)分子向三重態(tài)的 體系間竄躍速率加大，因而會使熒光效率降低?！舅伎碱}】1、試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因？答:原因是由于現代電子技術具有檢測十分微弱光信號的能力，并且熒光強度與 激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度也可以增大熒光強度，使測定的靈敏度提高； 而吸收光度法測定的是吸光度，不管是增大入射光強度，還是提高檢測器的靈敏 度，都會使透射光信號與入射光信號以同樣的比例增大，吸光度值不會改變，因 此靈敏